第三章 酶的分离纯化
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Amino acid analysis Protein sequencing Extinction coefficient
Partially Purified (50~90% pure)
Crude Protein (1% pure)
A 纯化阶段 B 分析方法
Material Background knowledge about Material
Protein / Activity assay
Extraction
(1) 粗蛋白
球 (glass bead)， 超声波振荡,
目标蛋白质是否确实抽取出來？
Juang RH (2004) ECX
■ 细胞打破之后：
(1) 降低温度 (2) 快速纯化 (3) 避免氧化 (4) 避免吸著 (5) 避免污染
Juang RH (2004) ECX
■
酶 纯 化 阶 段 及 分 析 方 法
Homogeneous (>99%)
● 抽取膜蛋白时須添加 Triton X 等表面活性劑
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.8
极性 非极性
■ 植物材料之特殊问题：
● 细胞壁： 较难打破 ● 叶绿体： 特有的酶 ● 液 泡： 有许多干扰物质
■ 植物的细胞壁问题：
较老组织的細胞壁很难打破
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.54
■ 植物色素在纯化上的问题：
● 色素经常吸附在胶体上难以去除
Scientific American
■ 细胞膜蛋白质抽取较困难：
目标酶的進一步精制纯化, 可用制备型电 泳或 HPLC 等。
■ 材料选择：
● 何种生物來源？ 动物、植物、微生物
● 何种组织？
根茎叶花果或组织培养
● 何种胞器？
细胞核、液泡、叶绿体
● 胞內或胞外酶？ 有关酶的稳定性
● 水溶性或脂溶性？ 影响提取策略的设计
■ 一 个 典 型 植 物 细 胞
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.3
第三章 酶的分离纯化
酶的分离纯化：是指将酶从细胞或其他含酶原 料中提取出来，再与杂质分开，获得与使用 目的要求相适应的有一定纯度的酶产品的过 程。
酶纯化的必要性：一种生物体含有数以千计的 不同的分子，它们包括复杂的高分子量化合 物，例如蛋白质、核酸、碳水化合物和复合 脂肪以及小分子的有机酸、碱、糖和盐。生 物体在细胞水平上精确地组织使得酶的分布 不是均一的。
如果需要研究一种酶的氨基酸组成、分子量、三级结 构、底物特异性或动力学参数，那么就必须将酶与其 它所有物质分离。在这种情况下，酶的纯化将是一项 重要的工作。
迄今为止，科学家们已把300多种酶制成了结晶，达 到了相当ห้องสมุดไป่ตู้的纯化程度，并发展了各种类型的分离纯 化方法。
酶的分离、纯化目的：在于获得一定量的、不含或少 含杂质的酶制品或者提纯为结晶，以利于在科学研究 或生产中应用。
下游工程属整个系统工程的后处理工艺技术， 解决如何提高酶和最终产物回收率以及纯度质 量问题。
酶的分离、纯化属生物技术的下游工程（Down stream process), 是提高产品获得率的关键。
酶的产量是以活力单位表示的，因此，在整个分离过 程中每一步始终贯穿比活力和总活力的检测。只有这 样才能确定酶的分离、纯化程度。
Pure Enzyme
Electrophoresis Naive-PAGE SDS-PAGE Gradient PAGE
Kinetic study Molecular weight Sedimentation coefficient
determination Quaternary structure (四级结构） Isoelectric focusing Peptide mapping
When ?
e. 如何纯化此蛋白质？ How ?
■ 酶的纯化过程，约可分为三个階段：
(1) 粗蛋白 (crude protein)︰
采样 → 均质打破細胞 → 抽出全部蛋白, 多用盐析沉淀法。
(2) 部分纯化 (partially purified)︰
初步的纯化, 使用各种管柱层析法。
(3) 均一酶 (homogeneous)︰
蛋白酶 (proteases) 多酚化合物 (polyphenols):
Alkaloid 生物碱 Flavanoid 类黃酮 Tannin 单宁
Juang RH (2004) ECX
■ 打破细胞的方法：
● 干式： 液态氮研磨, 磨粉机, 球磨机 (ball mill)
● 湿式： 均质器，果汁机, Polytron，研钵， 玻璃
以固定化酶、固定化细胞为重要内容的酶工程技术是 当今生物工程的重要组成部分。
食品酶学应用范围广阔，在整个生物工程领域离不开 酶学的应用。
■ 如何开始？
先考虑以下诸点：
5W
a. 要纯化哪一个蛋白质？ What ?
b. 为何要纯化此蛋白质？ Why ?
c. 由何种材料纯化？
Where?
d. 由哪一个生長期？
生物工程是属于高新技术领域的系统工程
生 物技术 （ 生物工程）
基因工程 细胞工程 酶工程 发酵工程
酶工程整个过程包括： 上游工程 (Up stream process, 缩写 UPS） 下游工程(Down stream process, 缩写DSP）
上游工程包括酶学基本理论、产酶动植物和微 生物种的改良，采用基因重组或细胞融合改造 产酶菌株，以及研究开发新的酶源，为开发利 用提供科学依据。
Protein fractionation
Ammonium sulfate Organic solvent
Chromatography
Gel filtration Ion exchange Affinity chromatography
Electrophoresis
Preparative electrophoresis Isoelectric focusing
Partially Purified (50~90% pure)
Crude Protein (1% pure)
A 纯化阶段 B 分析方法
Material Background knowledge about Material
Protein / Activity assay
Extraction
(1) 粗蛋白
球 (glass bead)， 超声波振荡,
目标蛋白质是否确实抽取出來？
Juang RH (2004) ECX
■ 细胞打破之后：
(1) 降低温度 (2) 快速纯化 (3) 避免氧化 (4) 避免吸著 (5) 避免污染
Juang RH (2004) ECX
■
酶 纯 化 阶 段 及 分 析 方 法
Homogeneous (>99%)
● 抽取膜蛋白时須添加 Triton X 等表面活性劑
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.8
极性 非极性
■ 植物材料之特殊问题：
● 细胞壁： 较难打破 ● 叶绿体： 特有的酶 ● 液 泡： 有许多干扰物质
■ 植物的细胞壁问题：
较老组织的細胞壁很难打破
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.54
■ 植物色素在纯化上的问题：
● 色素经常吸附在胶体上难以去除
Scientific American
■ 细胞膜蛋白质抽取较困难：
目标酶的進一步精制纯化, 可用制备型电 泳或 HPLC 等。
■ 材料选择：
● 何种生物來源？ 动物、植物、微生物
● 何种组织？
根茎叶花果或组织培养
● 何种胞器？
细胞核、液泡、叶绿体
● 胞內或胞外酶？ 有关酶的稳定性
● 水溶性或脂溶性？ 影响提取策略的设计
■ 一 个 典 型 植 物 细 胞
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.3
第三章 酶的分离纯化
酶的分离纯化：是指将酶从细胞或其他含酶原 料中提取出来，再与杂质分开，获得与使用 目的要求相适应的有一定纯度的酶产品的过 程。
酶纯化的必要性：一种生物体含有数以千计的 不同的分子，它们包括复杂的高分子量化合 物，例如蛋白质、核酸、碳水化合物和复合 脂肪以及小分子的有机酸、碱、糖和盐。生 物体在细胞水平上精确地组织使得酶的分布 不是均一的。
如果需要研究一种酶的氨基酸组成、分子量、三级结 构、底物特异性或动力学参数，那么就必须将酶与其 它所有物质分离。在这种情况下，酶的纯化将是一项 重要的工作。
迄今为止，科学家们已把300多种酶制成了结晶，达 到了相当ห้องสมุดไป่ตู้的纯化程度，并发展了各种类型的分离纯 化方法。
酶的分离、纯化目的：在于获得一定量的、不含或少 含杂质的酶制品或者提纯为结晶，以利于在科学研究 或生产中应用。
下游工程属整个系统工程的后处理工艺技术， 解决如何提高酶和最终产物回收率以及纯度质 量问题。
酶的分离、纯化属生物技术的下游工程（Down stream process), 是提高产品获得率的关键。
酶的产量是以活力单位表示的，因此，在整个分离过 程中每一步始终贯穿比活力和总活力的检测。只有这 样才能确定酶的分离、纯化程度。
Pure Enzyme
Electrophoresis Naive-PAGE SDS-PAGE Gradient PAGE
Kinetic study Molecular weight Sedimentation coefficient
determination Quaternary structure (四级结构） Isoelectric focusing Peptide mapping
When ?
e. 如何纯化此蛋白质？ How ?
■ 酶的纯化过程，约可分为三个階段：
(1) 粗蛋白 (crude protein)︰
采样 → 均质打破細胞 → 抽出全部蛋白, 多用盐析沉淀法。
(2) 部分纯化 (partially purified)︰
初步的纯化, 使用各种管柱层析法。
(3) 均一酶 (homogeneous)︰
蛋白酶 (proteases) 多酚化合物 (polyphenols):
Alkaloid 生物碱 Flavanoid 类黃酮 Tannin 单宁
Juang RH (2004) ECX
■ 打破细胞的方法：
● 干式： 液态氮研磨, 磨粉机, 球磨机 (ball mill)
● 湿式： 均质器，果汁机, Polytron，研钵， 玻璃
以固定化酶、固定化细胞为重要内容的酶工程技术是 当今生物工程的重要组成部分。
食品酶学应用范围广阔，在整个生物工程领域离不开 酶学的应用。
■ 如何开始？
先考虑以下诸点：
5W
a. 要纯化哪一个蛋白质？ What ?
b. 为何要纯化此蛋白质？ Why ?
c. 由何种材料纯化？
Where?
d. 由哪一个生長期？
生物工程是属于高新技术领域的系统工程
生 物技术 （ 生物工程）
基因工程 细胞工程 酶工程 发酵工程
酶工程整个过程包括： 上游工程 (Up stream process, 缩写 UPS） 下游工程(Down stream process, 缩写DSP）
上游工程包括酶学基本理论、产酶动植物和微 生物种的改良，采用基因重组或细胞融合改造 产酶菌株，以及研究开发新的酶源，为开发利 用提供科学依据。
Protein fractionation
Ammonium sulfate Organic solvent
Chromatography
Gel filtration Ion exchange Affinity chromatography
Electrophoresis
Preparative electrophoresis Isoelectric focusing