人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中差异表达基因的筛选
生理学报 Acta Physiologica Sinica , August 25, 2006, 58 (4): 370-376
https://www.360docs.net/doc/e49441110.html,
370
研究论文
Received 2006-03-30 Accepted 2006-06-02
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30400251).
*
Corresponding author. Tel: +86-10-62179164; Fax: +86-10-62173457; E-mail: jmchun@https://www.360docs.net/doc/e49441110.html,
人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中差异表达基因的筛选
刘美玲，石心泉，周万灏，刘洪文，李 东，贾孟春*
国家人口计划生育委员会科学技术研究所，北京 100081
摘 要：为了探讨人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)向成骨细胞分化过程中差异表达的基因，本实验采用体外培养人BMSCs ，诱导向成骨细胞分化。分别选取培养12和21 d 的细胞作为驱动方(driver)和实验方(tester)，进行抑制消减杂交，构建cDNA 消减文库，将挑选出的阳性克隆与GenBank 人基因库中已公布的核酸序列进行同源性比较分析。结果表明，从培养21 d 的BMSCs 中，筛查出5个差异基因，与人基因库中已知基因的同源性分别达到90%以上。有兴趣的是，核心蛋白聚糖和Bax inhibitor 1在培养21 d 的BMSCs 中差异表达。RT-PCR 检测显示，核心蛋白聚糖基因在培养21d 的细胞中高表达，而在12 d 的细胞中未检测到表达；Bax inhibitor 1基因在培养21 d 细胞中的表达明显高于12 d 的细胞。关键词：骨髓基质细胞；成骨细胞；核心蛋白聚糖；基因中图分类号：R 329
Screening differentially expressed genes in human bone marrow stromal cells at defined stage of differentiation
LIU Mei-Ling, SHI Xin-Quan, ZHOU Wan-Hao, LIU Hong-Wen, LI Dong, JIA Meng-Chun *
National Population Research Institute for Family Planning, Beijing 100081, China.
Abstract: To screen differentially expressed genes involved in osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells (BMSCs)at defined stages, subtractive cDNA library was established by means of suppression subtractive hybridization. The BMSCs cultured for 12 and 21 d were used as driver and tester, respectively. A subtract library was successfully constructed and five positive clones were selected from the library. Sequencing analysis and homology comparison showed that the five clones differentially expressed in BMSCs cultured for 21 d were at least 90% homologous with the known genes in human GenBank. It was interestingly found that the osteogenic BMSCs cultured for 21 d differentially expressed decorin and Bax inhibitor 1. RT-PCR was performed to confirm the differentially expressed genes. The results showed that the expression of Bax inhibitor 1 was significantly higher in the cells of 21-day than that of 12-day, while the expression of decorin was only detected in the cells of 21-day.Key words: bone marrow stromal cells; osteoblast; decorin; gene
正常骨量的维持需要骨祖细胞不断提供足够的成骨细胞，而正常骨转换中所需要的成骨细胞来源于骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)。BMSCs 是骨髓基质的一种间充质细胞，它能产生骨祖细胞系。BMSCs 具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下可向脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞，甚至神经细胞等分化[1,2]。定向分化的骨祖细胞首先增
殖并分化为前成骨细胞，同时表达I 型胶原和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)。I 型胶原的合成在细胞增殖期占主导地位，并与细胞的进一步分化有很大的关系。随后前成骨细胞分化为早期的成骨细胞并表达骨桥蛋白(osteopontin, OPN)，同时具有了骨基质形成的能力。最终，分化成熟的成骨细胞开始骨钙素(osteocalcin, OC)的表达，并进一步分化
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为骨矿化基质内的骨细胞、骨衬细胞，或者发生凋亡。OC是一个维生素K依赖、维生素D诱导的钙结合基质蛋白，是成骨细胞成熟的标志。OC的表达在矿化期开始，并逐渐达到高峰。在基质成熟期，ALP的活性进一步升高，而胶原合成则急剧下降。此外，其它蛋白和一些细胞因子也可在分化的不同阶段表达，如骨粘连蛋白(osteonectin, ON)和TGF-β1等在基质成熟期达到最高表达，而骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein, BSP)则要早于OC，在成熟晚期即开始表达。
BMSCs来源于骨髓，取材方便，具有良好的分化和增殖能力，目前被认为是较理想的骨组织工程种子细胞。体外培养BMSCs，利用地塞米松，维生素C和甘油磷酸钠可以诱导其分化发育为成骨细胞。近年来国内外的研究者已对BMSCs向成骨细胞分化做了大量研究[3-9]，但是国内对于调节BMSCs 分化的基因的研究甚少。
如何保证BMSCs能在特定的时间内定向扩增到临床治疗所需的数量，同时保证细胞不老化，并避免致瘤性的产生是目前亟待解决的问题。因此，研究BMSCs向成骨细胞分化相关的调控基因具有重要的现实和深远意义。
本研究取人BMSCs进行体外定向诱导培养，分别提取分化到早期的成骨细胞(12d)和成熟的成骨细胞(21d)的总RNA，利用抑制消减杂交技术(sup-pression subtractive hybridization, SSH)，筛查这两个阶段差异表达的基因，探讨BMSCs分化通路的分子生物学机制，为其作为组织工程种子细胞的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 在患者知情同意的情况下，获得外科手术残留的成年人新鲜肋骨组织(约1cm3)。根据临床检查和生化检测等手段，排除对骨代谢影响的疾病，如甲状腺疾病、糖尿病以及其他已知原因的骨代谢疾病。TRIzol RNA提取试剂购自Invitrogen公司；SMART PCR cDNA合成试剂盒/PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒、Advantage 2 PCR和PCR-Select Differential Screening试剂盒购自Clontech公司；QIA quick PCR纯化试剂盒购自QIAGEN公司；Taq DNA聚合酶、pGM-T Easy载体和DH5α菌株购自天根公司；引物由北京三博远志公司合成；Hybond N＋尼龙膜购自Pharmacia公司；[α-32P]-dCTP 购自北京亚辉公司。磷屏影像系统Cycl one购自
PerkinElmer Lifesciences (PELS) 公司。
1.2 方法
1.2.1 BMSCs培养和成骨细胞鉴定 α-MEM/ free细胞培养液成分：α-MEM粉末1包加2.2 g NaHCO
3
定容于1 000 ml ddH
2
O中，过滤除菌。α-MEM/all细胞培养液成分：在α-MEM/free培养液中加入10 mmol/L β-甘油磷酸钠，15% 胎牛血清，1×10-8 mol/L地塞米松，50 μg/ml维生素C，100 IU/ml青链霉素。细胞培养：将外科手术残留的成年人新鲜肋骨组织样本(约1cm3)用PBS洗，再用α-MEM/free培养液冲出骨髓细胞，室温1 000r/min离心10 min，弃上清，沉淀加入10 ml α-MEM/all培养液重悬。将重悬细胞液缓慢倒入10 ml Ficoll-Paque TM PLUS液上，室温下2 000r/min离心20 min，取中间白色云雾状细胞层，加10 ml PBS，室温1 000r/min离心10 min。沉淀细胞用PBS洗两次，加入2 ml α-MEM/all培养液重悬细胞，取10 μl镜
下计数后接种于培养瓶中，于37℃、5% CO
2
孵箱中培养。24h半量换液，之后2~3d换液一次。碱性磷酸酶染色(Gomori钙钴法)鉴定成骨细胞：将生长有细胞的盖片PBS冲洗后冷丙酮固定10min；双蒸水冲洗数次，加入孵育液，37℃、4h；自来水冲洗，在2%硝酸钴中浸3~5 min；蒸馏水洗数次，在1%硫化铵中浸2 min；自来水冲洗，自然干燥后封片。
1.2.2 总RNA的提取 按照TRIzol试剂的说明，分别提取上述培养了12和21 d的细胞总RNA，经纯化后溶于适量灭菌DEPC水中，紫外分光光度计定量，并各取5 μl电泳检测完整性。
1.2.3 单链cDNA (sscDNA)和双链cDNA (dscDNA)的合成 按照SMART PCR cDNA合成试剂盒的说明，分别将培养了12和21 d的细胞总RNA反转录成sscDNA。以稀释的sscDNA为模板，利用PCR 方法制备dscDNA，反应条件为95℃预变性1 min，然后95℃ 15 s，65℃ 30 s，68℃ 6 min，进行21个循环。合成s s c D N A和ds c D N A的引物均由SMART PCR cDNA合成试剂盒提供。
1.2.4 SSH 所得dscDNA纯化后，用限制性核酸内切酶Rsa I 37℃酶切约2 h，电泳检测酶切效果，纯化后分别进行正向消减和反向消减。正向消减的基本过程如下：以酶切所得的培养12 d的细胞dscDNA片段为驱动方(driver)、培养21 d的细胞
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dscDNA片段为实验方(tester)，将tester dscDNA分成两等份，分别连接接头1和接头2R，与变性的driver dscDNA片段在PCR仪中68℃杂交8 h，第一轮杂交结束后立即将二者混合，新加入变性driver dscDNA片段，进行68℃杂交过夜。反向消减则是以酶切所得的培养21 d的细胞dscDNA片段为驱动方(driver)，12 d的作为实验方(tester)，过程同上。将正向和反向消减产物分别进行两轮PCR扩增。第一轮PCR反应是以接头1和接头2R的外侧序列为引物，反应条件为94℃预变性30 s，而后95℃ 10 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，共28个循环；第二轮PCR反应是以接头1和接头2R的内侧序列为引物(巢式引物)，反应条件为94℃ 10 s，68℃ 30 s，72℃ 1.5 min，共12个循环。相应的非消减产物以同样的条件进行PCR扩增作为对照。
1.2.5 消减效率的分析 以正向消减杂交的第二轮PCR产物和相应的非消减对照的第二轮PCR产物为模板，用G3PDH的引物进行PCR反应，反应条件为94℃ 30 s，60℃ 30 s，68℃ 2 min，分别在18、23、28和33个循环结束时各取样5μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳分析消减效率。
1.2.6 cDNA消减文库的构建 正向消减杂交的第二轮PCR产物纯化，4℃过夜连接入pGM-T Easy 载体，连接反应产物转化感受态DH5α受体菌，接种在Amp+/X-gal/IPTG的LB培养板上，37℃培养过夜。
1.2.7 插入片段的PCR鉴定 从培养板上随机挑取生长良好的白色菌落接种在每孔含有800μl Amp+LB培养液的24孔板上，37℃振荡培养过夜。从每孔中各取0.3μl菌液为模板，用巢式引物进行PCR扩增，反应条件为95℃预变性1 min，94℃ 30 s，68℃ 3 min，共25个循环。各取5μl PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.8 斑点杂交筛选 各取5 μl上述PCR产物，加入等体积的0.6 mol/L NaOH，混匀变性5 min，按照96孔板的位置各转移2 μl到Hybond N+尼龙膜上，每张膜上96个点，重复制备两张膜，紫外交联。用[α-32P]-dCTP标记的正向和反向消减杂交第二轮PCR产物作为探针，分别与上述膜72℃杂交过夜。杂交结束后先用2×SSC/0.5% SDS缓冲液68℃洗四次，每次20 min，再用0.2×SSC/0.5% SDS缓冲液68℃洗2次，每次20 min。在滤纸上晾干，然后膜压磷屏曝光4 h，通过磷图像系统扫描得到膜上的图像。1.2.9 阳性克隆的测序及同源性比对分析 取斑点杂交筛选得到的阳性斑点，从24孔板找出对应的克隆，送北京三博远志公司测序，将测序结果在GenBank人基因库中利用BLAST软件进行序列同源性检索分析。
1.2.10 RT-PCR检测差异表达基因 用Primer Premier 5.0软件对核心蛋白聚糖(decorin)和Bax in-hibitor 1基因设计引物，分别以培养12和21 d的细胞RNA反转录得到的cDNA为模板， PCR方法扩增目的基因。核心蛋白聚糖：上游引物5’-AGCTG-AAGGAA TTGCCAGAA-3’，下游引物5’-TGGTGC-CCAGTTCTATGACA-3’；扩增条件，95℃预变性2 min，95℃ 15 s，54℃ 40 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃最终延伸5 min。Bax inhibitor 1：上游引物5’-ACGGACTCTGGAACCATGAA-3’，下游引物5’-AGCCGCCACAAACATACAA-3’；扩增条件，95℃预变性2 min，95℃ 15 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃最终延伸5 min。分别与目的基因以相同条件同时扩增持家基因G3PDH作为内参。
2 结果
2.1 培养细胞形态学观察和成骨细胞的鉴定
人BMSCs接种后24 h，见少量细胞贴壁，呈圆形；48 h 可见贴壁细胞逐渐增多；72 h 可见有少量细胞呈纺锤形；7 d后见细胞呈多种形态，有鳞片状、多角形、长梭形等，大部分细胞带有突起，数目和长短不一，且形成分散的集落，大小不等。第一次换液后，去除大部分血细胞，2~3次换液后完全去除血细胞。一周后见细胞增殖迅速，2周左右细胞集落间出现相互融合，部分密集处中心的细胞由多角形等转变为梭形，表现为成纤维样细胞。成骨诱导后用Gomori钙钴法染色碱性磷酸酶，可见细胞胞浆有黑色颗粒沉着，即APL阳性细胞，说明BMSCs已转化为成骨细胞(图1)。2.2 总RNA分析、dscDNA检测及酶切分析
对提取的总RNA用紫外分光光度仪测波长260 nm和280 nm处的吸光值，所测样品A
260
与A
280
比
值均大于1.8，纯度达到实验要求；通过A
260
的值计算总RNA的浓度；1.5％琼脂糖凝胶电泳分析(图2A)，样品总RNA中28S rRNA和18S rRNA条带十分明显，且二者亮度比值大于1.5，表明提取的RNA较完整。
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1.2%琼脂糖凝胶电泳分析合成dscDNA 的PCR 产物。结果显示，PCR 产物为弥散状，大部分分布于0.5~8 kb 之间(图2B )，达到实验设计的要求。
以未经酶切的dscDNA 作为对照， 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果(图2C )，弥散状的dscDNA 群体向低分子量DNA marker 处移动。2.3 SSH 结果分析
消减杂交产物和对照(消减前产物)经过两轮PCR
扩增后，电泳结果显示(图3)二者的扩增产物均为弥散状群体，但消减后产物的分布区域(250~1 000bp)明显小于消减前(250~2 000 bp 以上)，表明大部分共有基因已被消减掉。
图 1. 体外培养12 d 的人BMSCs
Fig.1. The human BMSCs were cultured for 12 d and stained for endogenous alkaline phosphatase by Gomori method. The black granules can be seen in the cytoplasm of ALP-positive cells. Scale bar, 100 μm.
2.4 消减效率的分析
以正向消减杂交的第二轮PCR 产物和非消减对照的第二轮PCR 产物为模板，用G3PDH 引物进行PCR 反应，于不同的循环数结束时取样同时电泳(图4)，结果显示，经消减后的G3PDH 条带在28个循环时出现，而非消减的G3PDH 条带在18个循环就开始出现，表明消减后G3PDH 的丰度明显降低，消减效率较高。
2.5 消减文库中插入片段的PCR 鉴定
对随机挑选的白色菌落用巢式引物进行PCR 扩增，部分结果如图5所示，插入片段中的大部分为单一特异条带，大小不一，基本都在100~1 000 bp 之间。
2.6 斑点杂交
经过DNA 斑点杂交，部分结果如图
6
所示，挑
图 3. SSH 的产物经两轮PCR 扩增后的电泳分析
Fig.3. SSH products amplified by two-round PCR. M, DNA marker; Lane 1, 2nd PCR products of unsubtracted control cDNA of forward subtraction; Lane 2, 2nd PCR products of unsubtracted control cDNA of reverse subtraction; Lane 3, 2nd PCR products of subtracted cDNA of forward subtraction; Lane 4, 2nd PCR products of subtracted cDNA of reverse subtraction.
图 2. 琼脂糖凝胶电泳分析总RNA 、dscDNA 及酶切结果
Fig.2. Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA, dscDNA and digested dscDNA. A : Total RNA from BMSCs cultured for 12d (D12) and 21 d (D21). B : dscDNA. M, 1 kb DNA ladder size marker. C : dscDNA. M, DL2000 DNA molecular marker; D12 and D21,undigested dscDNA; D12* and D21*, digested dscDNA.
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374选与正向消减探针有杂交信号、与反向消减探针无杂交信号的斑点为阳性克隆。2.7 阳性克隆的测序及分析
挑选出的阳性克隆由北京三博远志公司测序，结果与GenBank 中人基因库已公布的核酸序列进行同源性比较分析。从培养21 d 的BMSCs 中筛查出
5个差异基因，与人基因库中已知基因的同源性分别达到90%以上(表1)。有兴趣的发现是，核心蛋白聚糖和Bax inhibitor 1在培养21 d 的BMSCs 中差异表达。
2.8 差别基因的表达
PCR 产物经凝胶电泳分析显示核心蛋白聚糖基因在培养21 d 的细胞中高表达，而在12 d 的细胞中未检测到表达；Bax inhibitor 1基因在培养21 d 细胞中的表达明显高于12 d 的细胞(图7)。
图 5. 正向消减文库中插入片段的PCR 鉴定
Fig.5. Identification of the inserted cDNA fragments from the forward subtractive library.
表1. 同源性比对结果
Table 1. Results of homology comparison in GenBank Length Gene GenBank No.Homology
(bp)(%)173Decorin BT019800100630Cathepsin K NM_00039699474Ferritin heavy chain AY258285
99
570
Vacuolar H +-translocatiing NM_003945100
ATPase
670
Bax inhibitor 1
BC000916
99
图7. RT-PCR 检测核心蛋白聚糖和Bax inhibitor 1基因的表达
Fig.7. Confirmation of the expressions of decorin and Bax inhibi-tor 1 by RT-PCR. Lanes 1~2: PCR products of Bax inhibitor 1 from 12-day cells and 21-day cells, respectively; M, DL2000 DNA
molecular marker; Lanes 3~4: PCR products of decorin from 12-day cells and 21-day cells, respectively.
图 4. 消减前后G3PDH 的丰度变化
Fig.4. Reduction of G3PDH abundance by PCR-Select subtraction.1~4, subtracted products as templates; 1*~4*, unsubtracted prod-ucts as templates. Lanes 1, 1*: 18 cycles; Lanes 2, 2*: 23 cycles;Lanes 3, 3*: 28 cycles; Lanes 4, 4*: 33 cycles; M: DNA molecular marker.
图 6. 正向消减文库部分斑点杂交结果
Fig.6. Partial results of differential screening for the forward subtractive library. A : Membrane is hybridized with cDNA probes made from forward subtracted products. B : Membrane is identical to the corresponding A . The arrows designate the positive clones
screened from the forward subtractive library.
A
B
3 讨论
SSH 是1996年由Diatchenko 等[10]发明的，近几年较为广泛应用于筛选差异表达基因。该方法将驱
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动组和实验组进行两次消减杂交，再经两次特异的PCR扩增，结果大量富集差异表达基因，得到的差异基因片段的特异性很高，与传统的DD RT-PCR 相比[11]，显著降低了实验中的假阳性率。同时这项技术简便、快捷，一次实验可获得几十甚至上百个差异表达基因的片段，从而使该技术成为筛选差异表达基因的有力手段。
本研究以体外诱导向成骨细胞分化的人BMSCs 为实验材料，选取培养12和21 d的细胞分别作为驱动方和实验方，进行SSH。将所得差异基因与GenBank中人基因库已公布的核酸序列进行同源性比较分析发现，从培养21 d的BMSCs中筛查出5个差异基因与人基因库中已知基因的同源性分别达到90%以上。这5个基因分别是Bax inhibitor 1、核心蛋白聚糖、转铁蛋白重链(ferritin heavy chain)、组织蛋白酶K (cathepsin K)和空泡型质子泵(vacuolar H+-translocatiing ATPase, V-ATPase)。
Bax inhibitor-1是一种新发现的抗凋亡蛋白，早期研究命名为睾丸增强基因转录子(TEGT)，受Bcl-2和Bax的调控。现在证实在原核细胞、细菌、酵母、乃至病毒均有与人Bax inhibitor 1蛋白的同源蛋白表达[12]，说明该蛋白是一古老的抗凋亡而保护细胞的蛋白。研究发现Bax inhibitor 1蛋白在多种癌组织中高表达，如乳腺癌、肺腺癌、肝癌[13,14]。Bailly-Maitre等人用敲除该基因的小鼠研究发现，Bax in-hibitor 1蛋白能保护肝和肾组织细胞的内质网[15]。
核心蛋白聚糖是一种蛋白多糖(proteoglycans, PG)类物质，其生物学功能比较广泛。细胞外基质中的糖蛋白和蛋白多糖与多种生长因子和细胞因子结合而起到调节基质装配和骨形成的作用。Bi等人[16]通过核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖(biglycan)双基因突变的小鼠(bgn-/0dcn-/-)，研究蛋白多糖对BMSCs 成骨作用的调节，结果发现该种小鼠由于核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖的表达缺失，使得TGF-β不能与细胞外基质螯合，过量的TGF-β直接与BMSCs 的TGF-β受体结合，TGF-β信号通路过度激活导致体内的和体外培养的该种小鼠的BMSCs均大量凋亡，骨祖细胞数量减少和骨形成减少，说明细胞外基质中的蛋白多糖对BMSCs成骨作用的调节非常重要。
另外，对核心蛋白聚糖与胶原的相互作用进行了较多的研究，核心蛋白聚糖能与胶原连接，影响胶原纤维的结构和功能，能够抑制I型和II胶原纤维形成(type I and type II collagen fibrogenesis)[17]。我们在另一个实验中，体外培养小鼠BMSCs并诱导向成骨细胞分化，分别提取培养7、14和21 d细胞总RNA，采用实时荧光定量RT-PCR方法检测I 型胶原，发现随着培养时间延长，I型胶原的表达水平逐渐下降，培养14和21 d BMSCs的I型胶原mRNA水平分别是培养7 d时的0.75、0.04和0.34、0.03倍；在人的BMSCs体外培养的实验中也同样发现，随着培养时间延长，I型胶原的表达水平显著下降，培养15、18和21 d BMSCs I型胶原mRNA 水平分别是培养12 d时的0.261、0.024和0.024倍(尚未发表)。这一结果与本实验发现体外培养21 d 的BMSCs差异表达核心蛋白聚糖的现象是一致的，核心蛋白聚糖表达增加可能抑制I型胶原的表达。
除胶原外，核心蛋白聚糖还能与许多其他细胞因子结合，参与调节细胞的增生和迁移[18]。核心蛋白聚糖对炎症控制、伤口愈合、在组织矿化和细胞离子交换中也有重要作用，核心蛋白聚糖在机体矿化的早期起调节作用，是矿化的一个负调控因子[19]。
综上所述，SSH是筛选BMSCs向成骨细胞分化的不同阶段特异表达基因的有效方法。筛选出的差异基因在成骨细胞分化中所起的具体作用将进一步深入研究。
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19Hoshi K, Kemmotsu S, Takeuchi Y, Amizuka N, Ozawa H.
The primary calcification in bones follows removal of decorin and fusion of collagen fibrils. J Bone Miner Res 1999; 14(2): 273-280.
破骨细胞与成骨细胞
破骨细胞 (osteoclast，亦称bone-resorbing cells)是骨组织成分的一种，行使骨吸收（bone resorption）的功能。破骨细胞与成骨细胞（osteoblast，亦称bone-forming cells）在功能上相对应。二者协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。高表达的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase）和组织蛋白酶K（cathepsin K）是破骨细胞主要标志。 破骨细胞由多核巨细胞(multinuclear giant cell, MNGC)组成，直径100μm，含有2～50个紧密堆积的核，主要分布在骨质表面、骨内血管通道周围。由多个单核细胞融合而成的，胞浆嗜碱性但随着细胞的老化，渐变为嗜酸性。 作用 破骨细胞具有特殊的吸收功能，某些局部炎症病灶吸收中，巨噬细胞也参与骨吸收过程。 在破骨细胞吸收骨基质的有机物和矿质的过程中，造成基质表面不规则，形成近似细胞形状的陷窝，称为Howship 陷窝。在陷窝内对着骨质的
一面，细胞伸出许多毛样突起，很象上皮细胞表面的纵纹缘和刷毛缘。电镜下，贴近骨质的一侧有许多不规则的微绒毛，即细胞突起，称为皱褶缘(ruffled border)。在皱褶缘区的周缘有一环形的胞质区，含多量微丝，但缺乏其它细胞器，称为亮区(clear zone)，此处的细胞膜平整并紧贴在骨质的表面。亮区犹如一道以胞质构成的围墙，将所包围的区域形成一个微环境。破骨细胞向局部释放乳酸及柠檬酸等，在酸性条件下，骨内无机矿物质自皱褶缘吞饮，于皱褶缘基质内形成一些吞饮泡或吞噬泡。于破骨细胞内，无机质被降解，以钙离子的形式排入血流中。无机质的丢失使骨基质内的胶原纤维裸露，破骨细胞分泌多种溶酶体酶，特别是组织蛋白酶K和胶原溶解组织蛋白酶。破骨细胞离开骨表面后，其皱褶缘消失，细胞内发生变化，进入静止期。 成骨细胞 成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌
骨髓基质干细胞及其应用的研究进展(一)
骨髓基质干细胞及其应用的研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。【关键词】骨髓干细胞 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等，MSCs移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。本文对MSCs移植治疗脑缺血的研究综述。 1骨髓基质细胞的生物学特性 1.1目前发现至少存在3种形态的MSCs。Colter等从培养的人骨髓细胞中分离出MSCs后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平MSCs外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的MSCs能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将MSCs放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等1-3]。MSCs具有多向分化的潜能，MSCs经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时，MSCs即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞3，4]。 1.2MSCs的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化3]。 2骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞 最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，SanchozRamos等发现，表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derivedneuotroficfactor，BDNF)可诱导人及小鼠的少数MSCs分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuronspecificnuclearprotein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)。将人或小鼠的MSCs与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分MSCs分化为NeuN阳性的神经元样细胞及GFAP阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在MSCs的分化中发挥重要作用5]。 3MSCS移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理 3.1供体与受体 MSCs移植治疗脑缺血多为同种异体移植，如Brazelton等6]采用的供体鼠为成熟转基因大鼠，鼠龄8～10w，受体鼠为致死量放疗后的相同鼠龄的大鼠，移植的为新鲜未经培养的MSCs。有些学者将供体鼠化疗(5-氟尿嘧啶，150mg/kg，腹部注射)2d后取其骨髓进行体外培养3代，移植前72h加BrdU进行标记，受体鼠亦为相同鼠龄相同体重的同种鼠7]。Zhao等8]的研究中，hMSCs来自于10～35岁的健康志愿者，hMSCs转染了增强的绿色荧光蛋白基因，经26代培养后移植入成熟雄鼠体重(230～250g)，结果未出现免疫排斥反应，说明MSCs具有相当大的免疫反应调节能力。上述研究中，或是供体经化疗或是受体经放疗或是MSCs经多次传代培养以降低免疫活性，从而减少移植物抗宿主反应的发生。 3.2MSCs在脑内有迁移能力 Kopen等将小鼠MSCs注入新生小鼠侧脑室后12d，发现MSCs已迁移至前脑、小脑，而且不破坏脑组织结构，其迁移方式与出生后早期的神经发育过程相同，提示MSCs的行为类似神经前体细胞9]。 3.3目前MSCs移植治疗局灶性脑缺血的途径有3种：脑立体定向移植，经颈内动脉注射移植及经静脉注射移植
成骨细胞分化调控概览
The Regulatory Landscape of Osteogenic Differentiation Abstract 间质干细胞（MSCs）向成骨细胞的分化是骨发育和动态平衡的一个完整的部分，当它被不恰当地调控时，可能产生疾病，比如骨癌或骨质疏松。利用无偏倚的高通量方法，我们描述了在人类MSCs向骨谱系分化的过程中，基因表达，组蛋白修饰，以及DNA甲基化方面整体改变的图景。此外，我们第一次提供了一份基因组范围上的，关于骨主要调控转录因子Runt相关转录因子2（RUNX2）在人类成骨细胞中DNA结合位点的描述，显示出目标基因与增殖，迁移及凋亡调控有关，并与p53调控的基因有明显的重叠。这些发现扩展了正在出现的证据，这些证据是关于RUNX2在癌症，包括骨代谢，以及p53调控网络中有作用的。 我们进一步揭示了RUNX2结合在远端的调控元件，启动子上，还有很高的频率结合在基因的3’末尾上。最后，我们识别出了TEAD2和GTF2I是一种新的成骨调控因子。 Introduction 间质干细胞或者基质细胞（MSCs）有多谱系潜能，可以向成骨，成脂，成软骨，还有其它谱系分化 （1）。MSCs出现在骨髓和其它间质组织中，可能迁移到损伤或炎症处，参与组织修复 （2）。MSCs可在体外条件下被纯化并向成骨细胞分化，这为从分子上研究成骨提供了方便的工具 （1）。关于这一过程的更多知识，对基础研究及MSCs在骨骼再生医学上的临床应用都是十分重要的 （3），同样地，理解它在骨病中失调的情况也很重要，比如说癌症。
在这点上，非常有意思的是骨肉瘤，最常见的骨原发恶性肿瘤，可能是由基因及表观遗传上的改变打断了MSCs向成骨的分化所致 （4）。 干细胞分化受基因表达的变化所高度调控，这种变化在转录水平上与DNA 或染色质结合在转录调控子上有关，或是与染色质图像的局部改变有关 （5~7）。高通量方法的发展，比如RNA测序（RNA-Seq），以及染色质免疫沉淀及测序（CHIP-Seq），使人们可以对这种改变。 在基因组水平上进行描述（8，9）举例来说，RNA-Seq可以系统性地发现启动子与外显子的轮流使用 （10），而CHIP-Seq显示特定的组蛋白修饰区域，以及这些变化是如何改变基因活性的（5，8）。CHIP-Seq也使人们可以发现基因组结合位点，并为广泛的转录因子（TFs）寻找目标基因（11，12）。此外，综合基因组分析可以在整个基因组中识别功能区域，比如启动子和增强子，这些成果又可以被用来丰富新的转录因子结合位点（TFBS）分布，以帮助发现新的生物过程调控因子 （5）。 在单倍体RUNX2缺乏患者中的骨骼发育缺陷 （13），或是Runx2缺合子（nullizygous）小鼠中骨化骨的缺失（14，15），揭示了RUNT相关转录因子2（RUNX2，即CBFA1）对于骨的发育是不可或缺的。在成骨中，RUNX2涉及调控增殖，迁移，定型，以及向成骨谱系的分化（16~19）。RUNX2对上游信号起反应，调控基因的表达，这些上游信号包括TGFB，BMP及Wnt信号通路（20~23）；但是，成骨细胞中的下游目标被描述得就没有那么好。除了它在发育和失调中的作用，RUNX2还为人所知的是涉及肿瘤形成；RUNX2与MYC原癌基因协同，在造血谱系中启动瘤变发生 （24），近期的证据提示在乳腺癌和前列腺癌细胞中，RUNX2的肿瘤生长和代谢属性（25~27）。在骨肉瘤中，RUNX2常常是过度表达的，这与预后不良有联系
骨髓基质干细胞及其应用的研究进展
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 骨髓基质干细胞及其应用的研究进展骨髓基质干细胞及其应用的研究进展( 作者： 张秀云发表时间： 2019 年 11 月 ) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。 【关键词】骨髓干细胞骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。 近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等， MSCs 移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。 本文对MSCs 移植治疗脑缺血的研究综述。 1 骨髓基质细胞的生物学特性 1.1 目前发现至少存在 3 种形态的 MSCs。 Colter 等从培养的人骨髓细胞中分离出 MSCs 后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平 MSCs 外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的 1 / 9
MSCs 能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将 MSCs 放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等。 MSCs 具有多向分化的潜能，MSCs 经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时， MSCs 即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞。 1.2 MSCs 的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化。 2 骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs 在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，Sanchoz Ramos 等发现，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derived neuotrofic factor， BDNF)可诱导人及小鼠的少数 MSCs 分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其 RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP)。 将人或小鼠的 MSCs 与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分 MSCs 分化为 NeuN 阳性的神经元样细胞及 GFAP 阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在 MSCs 的分化中发挥重要作用。 3 MSCS 移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理
神经递质P物质通过调控转录因子Osterix的表达促进成骨细胞分化
神经递质P物质通过调控转录因子 Osterix的表达促进成骨细胞分化 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 作者：孙海飚，刘强，郭敏锋，张华平，陈君长 【摘要】目的研究神经递质P物质调控成骨细胞分化的分子途径。方法分离骨髓基质干细胞进行原代及传代培养；分别采用空白对照、P物质、P物质NK1受体拮抗剂、P物质+P物质NK1受体拮抗剂进行干预,诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞分化；传代培养1～2周后，抽提细胞总RNA，用RT PCR检测分化过程中Osterix基因的表达。检测结果重复3次,采用单因素方差分析检测结果。结果骨髓基质干细胞在生长对数增殖期为4～6d，采用RT PCR检测发现P物质干预成骨细胞分化，导致成骨细胞分化过程中重要的转录引子Osterix 基因表达，与其他各组比较有显著差异(P0.05)，Osterix基因表达上调，从而刺激前成骨细胞向成骨细胞转化。而P物质+P物质NK1受体拮抗剂共同干预，Osterix基因表达与空白对照组无显著差异(P0.05)，说明P物质通过P物质NK1受体对成骨细胞分化进行调控。结论P物质可调控前成骨细胞分化过程中转录因子Osterix基因表
达促进其向成骨细胞分化。P物质对Osterix基因表达的调控依赖P 物质NK1受体。 【关键词】P物质；成骨细胞；分化；Osterix ABSTRACT: Objective To study the molecular pathway of osteoblastic differentiation induced by substance P (SP), a neurotransmitter. Methods Mesenchymal stem cells were isolated and cultured, and treated with SP or its receptor (NK1) antagonist to induce osteoblastic cell differentiation, respectively. Alkaline phosphatase activity was determined; Osterix gene expression was detected by RT PCR after 1-2 weeks for three times. The data of each culture condition were analyzed using SPSS12.0 statistical software to determine whether the differences between conditions were significant. Results After 4-5 days culture, bone marrow stromal cells became spindle shaped, triangular or polygonic. They covered the plate surface, formed extensive cell sheets in each group after 11-12 days of culture, and then induced differentiation to osteoblast. SP up regulated the important transcription factor Osterix gene expression significantly (P0.05). Conclusion The up regulation of Osterix gene expression by SP may stimulate osteoblastic cell differentiation. SP s regulation depends on its receptor NK1. KEY WORDS: substance P; osteoblast; differentiation;
破骨细胞分化成熟因子及其信号转导通路_黄晓斌
#综述# 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30400240) 作者单位:300192 天津,中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所 通讯作者:黄晓斌,Email:HXB19800401@https://www.360docs.net/doc/e49441110.html, 破骨细胞分化成熟因子及其信号转导通路 黄晓斌 孙元明 李雨民 杨福军 摘要:破骨细胞从起源发育至成熟,再经活化发挥吸收作用是一个复杂的多级调控过程,始终都受到一系列细胞因子的影响。有些细胞因子对破骨细胞的成熟分化起促进作用,如:RANKL 、TNF -A 、IL -1、IL -6、1,25-(OH)2D 3、PTH 、M -CSF 等,其中RANKL 和M -CSF 是破骨细胞形成和分化过程中的两个必需的因子;有些因子起抑制作用,如:OPG 、IL -4、IL -10、雌激素、降钙素、TGF -B 等。OPG P RANK P RANKL 系统在破骨细胞分化成熟过程中起着枢纽作用,大部分细胞因子都直接或间接地通过OPG P RANK P RANKL 系统来发挥作用,其中还涉及到成骨细胞、破骨细胞、基质细胞等复杂的相互作用。介导破骨细胞分化成熟的各种细胞因子反应的信号传导路径主要包括MAPK 、NF -kappaB 、CN P NFAT 等通路,全面地了解破骨细胞因子及其信号传导通路,将有助于临床更好地分析各种骨代谢性疾病的病因及发病机制,进而为治疗提供理论依据。 关键词:破骨细胞;细胞因子;信号转导 The cytokines of osteoclast and their path o f signal transduction H U ANG Xiaobin ,SU N Yuanming ,LI Yumin ,et al .Department o f Biomedicine ,I nstitute of Radiation Medicine ,CAMS &PU MC ,Tian j in 300192,China Abstract :It is a complicated process that osteoclast differentiates from progenitor to mature osteoclast which have the function of bone resorption.There are series of cytokines and systemic hormones involved i n this phase.Some cytokines promote osteoclast developmen t,such as RANKL,TNF -A ,IL -1,IL -6,1、25-(OH)2D 3,PTH,M -CSF,and the list will go on,in which RANKL and M -CSF are essen tial.Other cytokines inhibi t osteoclast growth,such as OPG,IL -4,IL -10,estrogen,calcitonin,TGF -B ,and so on.The OPG P RANK P RANKL system is vi tal in the period.Most of cytokines play role through OPG P RANK P RANKL system directly or indi rectly.The interaction between osteoclast and os teoblast or stromal cell i s also important.There are several si gnal path ways such as MAPK,NF -kappaB and CN P NFAT,involved in osteoclast di fferentiation.Understanding the cytoki nes of osteoclast and path of signal transduction respectively make i t possible for us to comprehend the developmen t and the treatment of the bone metabolic diseases. Key words :Os teoelast;Cytokine;Si gnal transduction 骨是一不断更新的组织,骨吸收和骨形成的动态平衡维持着正常的骨代谢。骨吸收的主要细胞是破骨细胞(osteoclast,OC)。破骨细胞是体内高度专业化的细胞,来源于造血干细胞的单核-巨噬细胞前 体分支。破骨细胞前体细胞是单核细胞,含皱折缘。当这些单核细胞贴附于骨表面时,在一定的微环境中形成成熟的TRAP 阳性的多核破骨细胞。成熟的破骨细胞形态多为不规则的圆形或卵圆形,大小不 等,形状不一,直径约20~100L m,含有2~50个核,核膜光滑,染色质颗粒微细,分布均匀。破骨细胞在分化成熟过程中受到一系列细胞因子的影响。 1 破骨细胞分化成熟因子 111 肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factors,TNFs) 破骨细胞分化成熟的过程中,有三个非常重要的因子,即骨保护素(OPG)、细胞核因子kappaB 受体活化因子(RANK)、细胞核因子kappaB 受体活化因子配基(RANKL),它们都是肿瘤坏死因子配体和受体家族成员,这三个因子所形成的OPG P RANKL P RANK 系统介导了OC 形成、分化过程中所必须的细
自体骨髓基质干细胞移植联合EPO治疗脊髓损伤的研究
自体骨髓基质干细胞移植联合EPO治疗脊髓损伤的研究 目的：探讨自体骨髓基质干细胞（MSCs）移植联合促红细胞生成素（EPO）对大鼠脊髓损伤（SCI）治疗的效果。方法：培养与纯化骨髓基质干细胞。80只SD大鼠制备脊髓损伤模型，随机分为4组：干细胞移植组、EPO组、联合组和对照组。采用BBB法进行运动能力评分和组织切片观察来评定修复情况。结果：三个实验组与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），三个实验组均可明显促进大鼠运动功能和损伤后组织结构的恢复，其中联合组效果更显著。结论：骨髓基质干细胞移植联合EPO具有促进大鼠脊髓损伤后神经功能的修复。 脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种常见的神经系统损伤，其致残率和病死率均较高。目前，脊髓损伤在临床治疗后神经功能的恢复效果不甚理想[1-5]，急需改进，所以，脊髓损伤的治疗一直是医学研究的热点问题[6-7]。骨髓基质干细胞（MSCs）具有高度增殖和向多种细胞分化的潜能，可分化为对神经递质敏感且具有神经电生理特性的细胞，还可以产生多种神经生长因子促进受损的神经纤维修复，移植后可促进脊髓损伤的修复[8]，而且可以自体移植，因此骨髓基质干细胞是治疗脊髓损伤的理想种子细胞[9-10]。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是一种由肾脏产生的内分泌激素，一直作为治疗贫血的药物而应用于临床。随着人们对EPO研究的深入，EPO已被证实是一种新型的神经保护和营养因子，具有神经营养和神经保护作用[11]。本实验将骨髓基质干细胞和促红细胞生成素联合应用于脊髓损伤大鼠，探讨骨髓基质干细胞和促红细胞生成素联合应用是否有协同效应。 1 材料与方法 1.1 实验材料和设备成年雄性SD大鼠80只，体重200～240 g；8周龄雄性SD大鼠4只，体重约100 g（均由哈尔滨医科大学动物试验中心提供）。二氧化碳细胞培养箱（德国Heraeus公司），倒置相差显微镜（日本奥林帕斯公司），低温离心机（德国Heraeus公司），单人双面净化工作台（苏州净化）超纯水净化器（美国Millipore公司），DMEM培养基，Percoll分层液。 1.2 实验方法 1.2.1 建立脊髓损伤模型与分组8周龄的SD大鼠用于骨髓基质干细胞的分离、培养和纯化。成年SD大鼠水合氯醛麻醉后，俯卧位固定，找到T10棘突，向上和向下5 cm范围内进行剪毛消毒。沿正中线切一3 cm长的切口，暴露椎旁肌肉，用玻璃分针剥离肌肉，用骨钳咬除棘突和椎板，形成方形骨窗，暴露T10脊髓，用脊髓损伤打击器打击制成SCI模型。造模的标准是：脊髓出现出血、水肿、后肢迟缓性瘫痪和尾巴痉挛性摆动。冲洗切口后局部使用青霉素，以防感染，缝合后放回鼠笼喂养。按随机的方式将80只SCI模型的大鼠分为对照组、骨髓基质干细胞应用组、促红细胞生成素应用组和联合应用组，每组20只。对照组每只鼠在脊髓损伤前1 d经腹腔注射相同量的生理盐水。骨髓基质干细胞治疗组将每只鼠采取尾静脉注射的方法在脊髓损伤后给予第3代培养的骨髓基质干细
成骨细胞骨形成机制
浅谈骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物 质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至 被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持 正常骨量的关键。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和 矿化。目前，随着研究的不断深入，在骨形成过程中，成骨细胞发展及其调控的分 子机制也逐渐得以揭示。 1成骨细胞的起源 成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，除成骨细胞外，基质细胞还可分 化成软骨细胞，成纤维细胞，脂肪细胞或肌细胞。成骨细胞来源谱系有以下几种：(1)骨髓克隆形成单位(成纤维细胞集落形成单位，cfu-f)；(2)骨祖细胞，可分化 成前成骨细胞和前软骨细胞谱系，常位于骨髓腔中，有很强的自身增殖能力；(3)
前成骨细胞，即最近的成骨前体，能定向分化成成骨细胞，具有合成和增殖能力［ 1，2］。成骨细胞由多能的间质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发展而来， 调控因素主要有bmp-2，bmp-2能诱导基质细胞向成骨细胞分化，具体就是诱导间质干细胞分化形成骨祖细胞进而形成前成骨细胞［3］。 2成骨细胞发展阶段及骨形成机制 成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质 矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成 。 成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌?型胶原 以便最终可以矿化形成骨结节。对成骨细胞增殖的调控具体说来即是对细胞周期的 调控，后者包括细胞在有丝分裂原作用下复制dna和细胞分裂的调节机制，典型的
骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展
骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展骨髓基质干细胞具有取材简单、增殖速度快、培养过程中始终保持多向分 化的潜能等特点，已经成为干细胞研究领域的热点，是最好的组织工程种子细胞之一，还可以诱导分化为神经细胞。本文对骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展作一综述。 [Abstract] Bone marrow stromal cells has derived simple，fast growth，the training process remains much to differentiate and other characteristics，has been become the hot spot in the study of stem cells，is one of the best seed cells of tissue engineering.It can also differentiate into neural cells.The article reviewes the progress of induction of bone marrow stromal cells to neural cells and its mechanisms. [Key words] Bone marrow stromal cells；Neural cells；Bone marrow 骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）位于骨髓中，是具有自我复制和多向分化潜能的非造血干细胞[1]。由于BMSCs具有取材容易、培养简单、增殖能力强、可以传代并且不改变生物学特性以及没有伦理学及免疫排斥等优点而备受瞩目[2-3]，BMSCs为治疗中枢神经系统疾病的一种理想供体细胞[4-6]。本文将BMSCs诱导分化为神经细胞的研究现状作一综述。 1 BMSCs定向分化为神经细胞的研究现状 1.1 体内定向分化 大量研究表明，BMSCs在体内可以分化为神经细胞。有学者将来源于人的BMSCs注入小鼠纹状体内，5～72 d后发现，在脑组织切片上有供体细胞存在，同时无明显炎症反应和排斥反应[7]。Mezey等[8]进行了雄性和雌性小鼠BMSCs 移植实验，将雄性小鼠的BMSCs植入雌性小鼠体内，一段时间后进行检测发现有携带Y染色体的神经细胞出现在雌性小鼠体内，提示雄性小鼠的BMSCs在雌性小鼠的体内分化成神经细胞。Guillermo等[9]将BrdU标记的大鼠BMSCs注入胎龄为15 d的大鼠胚胎的侧脑室内，在胎龄18、20 d时检测发现移植的细胞形成细胞团，2个月时检测仍有少量的移植细胞存活，表明BMSCs可以在脑的微环境中分化为神经细胞并存活较长时间。Chen等[10]将BMSCs应用于脑外伤动物，发现其能分化为神经细胞，并对神经功能的恢复有明显的促进作用。上述实验表明，BMSCs在体内可以迁移、存活、在相应部位的微环境影响下可分化为神经细胞，并能发挥一定的神经修复功能。 1.2 体外定向分化 能在体外分化为有较完整功能的神经细胞，是BMSCs作为神经细胞移植的来源细胞应用于临床的基础，很多学者在如何诱导BMSCs分化为神经细胞方面做了大量有益的探索，取得了较大进展，截止目前，诱导方法大致可归纳为以下
成骨分化相关信号通路的研究进展
Advances in Clinical Medicine 临床医学进展, 2017, 7(4), 235-241 Published Online October 2017 in Hans. https://www.360docs.net/doc/e49441110.html,/journal/acm https://https://www.360docs.net/doc/e49441110.html,/10.12677/acm.2017.74039 Research Progress of Osteogenesis-Related Signaling Pathways Lei Zhou, Minghai Wang* Department of Orthopedics, The Fifth People’s Hospital of Shanghai, Fudan University, Shanghai Received: Sep. 27th, 2017; accepted: Oct. 7th, 2017; published: Oct. 16th, 2017 Abstract Objective: Osteogenesis is the foundation of bone formation and key procedure of bone metabol-ism. In recent years, major progress was made in the molecular mechanism of osteogenesis at home and abroad. Therefore, the mechanism and research progress of osteogenesis-related sig-naling pathways was reviewed. Methods: Literature about ossification and osteogenesis-relate signaling pathways in recent years were reviewed and analyzed. Results: Several signaling path-ways have been found osteogenesis-related, among them, BMP-SMAD, Wnt/β-Catenin, Notch, Hedgehog, MAPK and FGF signaling pathways play the leading role in bone-formation. Besides, a complex regulatory network is composed of interactions between multiple signaling pathways. However, the specific mechanism of osteogenesis-related signaling pathways is still unclear be-cause of limited research methods. Conclusion: To make clear the mechanism of these signaling pathways respectively and their interactions is of great significance for illustrating the complete mechanism of osteogenesis. Keywords Bone Metabolism, Osteogenesis, Signaling Pathway 成骨分化相关信号通路的研究进展 周雷，王明海* 复旦大学附属上海市第五人民医院骨科，上海 收稿日期：2017年9月27日；录用日期：2017年10月7日；发布日期：2017年10月16日 *通讯作者。
破骨细胞
破骨细胞在骨吸收部位，与骨接触后，由基质产生的信号向胞内分泌囊泡含H-ATP酶，向微环境释放蛋白水解酶。其中，无机钙及磷酸盐的降解是通过ATP酶介导的质子分泌。在吸收陷窝处产生一个酸性环境，而有机基质，主要由胶原和弹性蛋白组成，由半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶降解，其中组织水解酶K起主要作用。 DC分泌IL1/6、TNFα。增加破骨细胞释放TRAP和组织水解酶K，还可以促进破骨细胞生成通过刺激T 细胞表达RANKL。 未成熟的DC可发育为破骨细胞样的细胞， 巨噬细胞在炎症中融合主要依赖IL4 RANKL-induced differentiation of osteoclasts in vitro was performed as described previously (12). In brief, primary osteoclast precursors (nonad- herent mouse bone marrow cells, splenocytes, and RAW 264.7) were sus- pended in -MEM supplemented with 10% FBS and cultured in a 24-well culture plate at 1 10 6 cells per well. After 48 h, the culture medium was replaced with fresh culture medium with or without 100 ng/ml mouse re- combinant soluble RANKL (Wako Pure Chemical). After 4 days, cells were dehydrated with ethanol-acetone (1:1) for 1 min, dried, and stained at room temperature with TRAP staining solution. TRAP-positive cells ap- peared dark red. We counted TRAP-positive multinucleated cells contain- ing three or more nuclei as osteoclasts.常用的评价方法有生化指标的测量、骨密度测量、骨组织计量学观察、骨生物力学指标检测等。其中生化指标和骨组织计量学是主要的指标 破骨细胞细胞体相当大，直径20-100um，有多个细胞核，积聚在一起，通常有15~20个。 被激活的破骨细胞靠粘附蛋白连接在骨表面，同时刺激骨被覆细胞收缩成团，暴露出钙化骨面，破骨细胞的腹部与暴露的骨表面形成一个密闭的小空间，不断的释放酸和溶酶体，使骨基质脱钙后降解而实现溶骨的功能。破骨细胞存活7周左右，在完成破骨功能后自然凋亡。OPG作为分化负向调节因子。 正常情况下，破骨细胞粘附于骨表面但并不粗糙，而粗糙的边缘则是骨吸收活跃的标志。阿仑膦酸钠不影响破骨细胞的聚集或粘附，但它确实能够抑制破骨细胞的活性。小鼠体内进行的有关标记有放射性活性的[3H]阿仑膦酸钠在骨内作用部位的研究显示，破骨细胞表面的摄入是成骨细胞表面的10倍。标记有放射活性[3H]阿仑膦酸钠分别给予大鼠6天和小鼠49天后，检查其骨组织发现，正常骨形成于阿仑膦酸钠上面，后者与基质结合后不再具有药理活性，因此阿仑膦酸钠必须持续服用以抑制新形成的吸收表面的破骨细胞。狒狒和大鼠的组织形态测量学显示，阿仑膦酸钠能降低骨转换（即，骨重建部位的数量），而且在这些重建部位，骨形成超过骨吸收，从而使骨量增加。‘ 骨质疏松症是一个世界范围的、越来越引起人们重视的健康问题。目前全世界约2亿人患有骨质疏松，其发病率已跃居常见病、多发病的第七位。当前，我国已进入老龄社会，老年病尤其是骨质疏松症的防治成为重要的
成骨细胞骨形成机制研究解读
成骨细胞骨形成机制研究 发布时间：2003-1-14 作者：童安莉陈璐璐、丁桂芝 骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至 被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持 正常骨量的关键。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和 矿化。目前，随着研究的不断深入，在骨形成过程中，成骨细胞发展及其调控的分 子机制也逐渐得以揭示。 1 成骨细胞的起源 成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，除成骨细胞外，基质细胞还可分 化成软骨细胞，成纤维细胞，脂肪细胞或肌细胞。成骨细胞来源谱系有以下几种： (1)骨髓克隆形成单位(成纤维细胞集落形成单位，CFU-F)；(2)骨祖细胞，可分化 成前成骨细胞和前软骨细胞谱系，常位于骨髓腔中，有很强的自身增殖能力； (3) 前成骨细胞，即最近的成骨前体，能定向分化成成骨细胞，具有合成和增殖能力［ 1，2］。成骨细胞由多能的间质干细胞在体内的各种调控因素的调节下发展而来， 调控因素主要有BMP-2，BMP-2能诱导基质细胞向成骨细胞分化，具体就是诱导间质 干细胞分化形成骨祖细胞进而形成前成骨细胞［3］。 2 成骨细胞发展阶段及骨形成机制 成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、细胞外基质 矿化和成骨细胞凋亡四个阶段。很多因素可调节这几个阶段，从而最终调控骨形成 。 成骨细胞增殖期成骨细胞数量增加，以形成多层细胞，并合成、分泌Ⅰ型胶原 以便最终可以矿化形成骨结节。对成骨细胞增殖的调控具体说来即是对细胞周期的
调控成骨细胞分化及骨形成关键信号通路的研究进展
调控成骨细胞分化及骨形成关键信号通路的研究进展 徐练孔清泉 【摘 要】目的综述在成骨细胞分化及骨形成过程中起关键调节作用的相关信号通路作用机制及研究进展。方法查阅近年来与成骨细胞分化及骨形成信号通路相关的文献，并进行综合分析。结果目前已发现多条信号通路参与了成骨细胞分化及骨形成的调节，其中BMP-Smads、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、FGF信号通路的作用最关键。这些信号通路不但自身具有较复杂的调控机制，而且彼此相互联系、相互影响，从而组成了一个更复杂而精细的调控网络，共同参与成骨细胞分化及骨形成的调节。然而，由于相关动物实验技术不成熟，临床试验研究较少，其详细作用机制体系仍不十分明了。结论对成骨相关信号通路的进一步深入研究，将有望彻底揭开成骨细胞分化及骨形成过程的完整分子机制，从而为临床有效防治成骨分化及骨形成异常性疾病提供理论依据。 【关键词】 MSCs成骨细胞分化 骨形成 信号通路 RESEARCH PROGRESS OF KEY SIGNALING PATHWAYS IN OSTEOBLAST DIFFERENTIATION AND BONE FORMATION REGULATION/XU Lian, KONG Qingquan. Department of Orthopaedics, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China. Corresponding author: KONG Qingquan, E-mail: kqqspine@https://www.360docs.net/doc/e49441110.html, 【Abstract】Objective To review the mechanism and research progress of signaling pathways which play key roles in the regulation of osteoblast diff erentiation and bone formation. Methods Recent articles about signaling pathways of osteoblast diff erentiation and bone formation were reviewed and comprehensively analyzed. Results At present, multiple signaling pathways have been found to be involved in the regulation of osteoblast diff erentiation and bone formation, among which bone morphogenetic protein-Smads, Wnt/β-catenin, Notch, Hedgehog, and fi broblast growth factor signaling pathways may play the most important roles. Not only each pathway has a complex regulatory mechanism itself, but also contacts and impacts with each other, thus they formed a more complicated and sophisticated regulatory network, and regulate together osteoblast diff erentiation and bone formation. However, the mechanisms in detail of those pathways are still not very clear, because the animal experiment techniques are not yet mature as well as the relevant clinical trials were carried out not too much. Conclusion The complete molecular mechanism of osteoblast diff erentiation and bone formation should be further investigated, so as to lay a theory foundation for preventing and treating the common bone diseases in clinical which are involve in osteoblast diff erentiation and bone formation. 【Key words】 Mesenchymal stem cells Osteoblast diff erentiation Bone formation Signaling pathway Foundation item: National Natural Science Foundation of China (81171731) 成骨细胞是人体骨组织的重要组成成分，也是参与骨形成的主要功能细胞，在骨骼生长发育及骨量维持方面扮演着关键角色。它来源于具有多向分化潜能的MSCs，经细胞增殖、细胞外基质合成、成熟及矿化后最终发展成为骨细胞，从而促进骨形成及维持骨量。从分子生物学水平上看，目前已知多条信号通路参与了成骨细胞分化过程的调节，其中最重要的信号通路包括BMP-Smads、Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）、Notch、Hedgehog、FGF等。这些信号通路在调控成骨 DOI：10.7507/1002-1892.20140321 基金项目：国家自然科学基金资助项目（81171731） 作者单位：四川大学华西医院骨科（成都，610041） 通讯作者：孔清泉，副教授，硕士生导师，研究方向：脊柱外科，E-mail: kqqspine@https://www.360docs.net/doc/e49441110.html, 网络出版时间：2014-10-21 17:16:33；网络出版地址：http://www. https://www.360docs.net/doc/e49441110.html,/kcms/detail/51.1372.R.20141021.1716.024.html 细胞分化及骨生成方面起着重要作用，一旦其中一条或数条信号通路调节受阻，都会引起成骨细胞分化异常或骨形成障碍，进而导致相应骨代谢疾病的发生，如骨质疏松症、骨硬化症等。因此，为了更好地认识和治疗这类疾患，阐明这些信号通路在调节成骨细胞分化及骨形成方面的作用机制及规律具有重要意义。现对成骨细胞分化及骨形成过程中起关键调节作用的信号通路的相关研究进展作一综述，为下一步研究奠定基础。 1概述 成骨细胞作为骨形成的主要功能细胞，在分化成熟过程中会逐步表达如ALP、骨钙素、血清Ⅰ型前胶原C端肽等特异性标志物。同时，在此过程中也会受到一系列转录因子的调控，如Runt相关转录因子