蛋白质组学技术及其在植物逆境生物学中的应用

蛋白质组学技术及其在植物逆境生物学中的应用

摘要：逆境胁迫是制约植物生长发育、影响作物产量和质量的关键因子，揭示植物应答胁迫的分子机理一直是人们长期探索的重大课题。植物的蛋白质组学研究可以系统揭示不同胁迫条件下植物蛋白质的表达状况，从而深入了解环境胁迫下植物的基因表达调控机制、植物响应胁迫机理。简要介绍了蛋白质组学的研究技术，概述了其在植物逆境胁迫适应机制研究中的应用，并对蛋白质组学在该领域的发展前景进行了展望。

关键词：蛋白质组学；非生物胁迫；生物胁迫；双向电泳；质谱

随着生命科学的日益发展，对基因功能的研究已不仅仅局限在核酸水平。蛋白质是基因功能的执行者，是生命现象的直接体现者。要深入了解生命的复杂活动，就需要从蛋白质的整体水平上进行研究。蛋白质组学是指研究蛋白质组的科学，本质上是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于组织变化、细胞代谢等过程的整体而全面的认识[1]。近些年来，蛋白质组学发展迅速，并得到了广泛的应用，成为生命科学研究的核心内容之一。

植物在生长发育过程中会遭遇高（低）温、干旱、水涝和高盐等非生物胁迫以及病原菌侵染和虫害等生物胁迫。植物感受逆境信号后，可以通过信号转导调节细胞内抗逆相关蛋白的表达，从而调整自身的生理状态或形态来提高对逆境的耐受能力。在蛋白水平，对发生变化的蛋白质进行定性和定量测定，探讨植物在逆境胁迫条件下的调控机制，是研究植物抗逆性的重要手段之一，并已在多种植物的研究中取得了一定的成果。

1 蛋白质组学研究技术

过去，许多科学家都致力于蛋白质组的大规模定性分析，而现在，如何系统地识别和定量一个蛋白质组则是蛋白质组学研究的主要目的之一[2]。由于蛋白质的浓度在很大程度上影响了其功能的实现，因此，对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量也就变得至关重要。目前，比较成熟的蛋白质定量方法主要分为两类，一类基于传统双向凝胶电泳及染色，另一类基于质谱检测技术。

1.1 基于凝胶的定量蛋白质组学技术

双向电泳（Two dimensional electrophoresis，2DE）技术是由O’Farrell于20世纪70年代建立的[3]，具有高分辨率的特点，通常能分辨出1 000～3 000个蛋白点[4]。该技术自诞生以来，一直在不断改进和优化。目前，应用比较广泛的双向电泳技术主要是双向荧光差异凝胶电泳（Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）。但双向电泳本身也存在着一些弊端：试验重复性差；对蛋白质的分离受到蛋白丰度、等电点、相对分子质量和疏水性等的限制；自动化程度低；操作起来费时费力等，这些都在一定程度上限制了该技术的应用。

1.2 基于质谱的定量蛋白质组学技术

基于质谱的蛋白质组学定量技术可以分为两大类：标记定量技术（Labeling quantitation）和非标记定量技术（Label-free quantitation）[2]。此外，标记或非标记的鸟枪蛋白质组学策略也是基于质谱技术的常用方法。

1.2.1 标记定量技术

1.2.1.1 同位素代谢标记法

同位素代谢标记以同位素元素或同位素标记氨基酸形式掺入到细胞培养基中，在细胞生长代谢过程中完成蛋白质同位素标记。此方法的显著优点是蛋白质在样品制备的初期被标记，由此减少了试验操作造成的误差，从而提高了准确度。目前比较常用的方法包括15N体内代谢标记和细胞培养中稳定同位素标记氨基酸（Stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC）方法。

1）15N体内代谢标记法。采用含有15N（或14N）作为惟一氮源的培养基来培养植物组织（植株），依靠掺入合成蛋白质的15N实现定量[5]。这项技术适用于多种蛋白提取物的蛋白质定量，包括那些需要进行大量纯化步骤、蛋白产量易发生改变的[6]。其优势还在于可应用于水培植物，使得植物对养分的吸收得到更好的控制。

2）SILAC方法。依靠在培养介质中加入稳定同位素标记的必需氨基酸（如赖氨酸或精氨酸等）实现对蛋白质的定量，已经广泛用于高等动物细胞蛋白质的鉴定及定量[5]。SILAC法标记效率高、损失小；标记误差低，可靠性高。然而，由于植物细胞本身可以合成这些必需氨基酸，导致只有部分蛋白质被标记。并且，此方法成本较高，导致其在植物蛋白质组学研究中的应用受到了一定的限制。

1.2.1.2 同位素化学标记法

1）同位素亲和标记法。比较典型且已商业化的一项技术是同位素亲和标记技术（Isotope coded affinity tages，ICAT）。ICAT 无需繁冗的双向凝胶电泳技术，标记策略灵活多变，可对低丰度、难溶性蛋白进行分析。近些年来，该技术与不同的质谱技术联合应用得到了广泛的研究。但ICAT适用于含半胱氨酸或半胱氨酸存在修饰的蛋白质。

2）酶催化18O-同位素标记法。酶催化18O-同位素标记法是通过加入H218O，在蛋白酶催化作用下将羧基上的2个16O替换成18O，从而对肽段进行标记。该技术有以下优点：操作简单；标记效率高，准确率高；应用范围广，可用于多种不同类型的蛋白质；可标记所有酶解的肽段，使相对定量所有的蛋白质成为可能；反应条件温和、副产物少；便于与磷酸化肽段富集方法联用，适于低丰度磷酸化肽段的定量标记肽段；在蛋白质水解分裂的同时被标记上，避免了人为因素的干扰。但由于标记后的蛋白质样品过于复杂，该技术还有待进一步的完善。3）

相对和绝对定量同位素标记法。相对和绝对定量同位素标记（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技术是美国应用生物系统公司在2004 年推出的一项新的体外同位素标记技术[7]。该技术使用8种（或4种）不同的同位素试剂来同时标记和比较8种（或4种）不同的蛋白质样品。如今该技术的应用越来越广泛，其优越性也逐步在许多生物体和组织研究中得到了证明，已成为目前蛋白质组学定量方法中一个十分重要的技术。

iTRAQ技术有如下特点：①样本量大。可对多达4个样本同时相对量化，大大降低了试验过程中所引入的技术误差；②定性分析结果可靠。可以同时给出每一个组分的相对分子质量和丰富的结构信息；③灵敏度、准确度高。将离子抑制效应、背景噪音和仪器条件等系统误差的影响降到最小，获得的变异系数在9%的范围；④分离能力强，分析范围广。作为标记的反应不在活细胞，适合任何类型的蛋白质样品，包括高相对分子质量蛋白质、酸性蛋白质、碱性蛋白质、不溶性蛋白质（eg.膜蛋白）等；⑤分析时间快，自动化程度高。

当然，iTRAQ标记技术也有自己的局限性。对全组蛋白质而言，它只能对相对丰度进行比较，因此只能提供相对的定量；数据的复杂度更高，因此需要开发更多的信息学工具；高丰度蛋白质干涉了低丰度蛋白质的检测和鉴定；每次试验，研究人员都必须鉴别全部的蛋白质组[8]。

1.2.2 非标记定量技术非标记定量法（Label-free）是一种新兴的蛋白质定量方法，包括基于色谱峰面积定量法及利用二级离子信号的强度进行MRM（多反应监测）检测等。与标记定量法相比，非标记定量法不需要花费大量时间准备同位素化合物，也不需要使用非常昂贵的试剂，但该技术比较依赖于仪器的状态、样品的复杂性以及一些未知因素，其灵敏度和精确度都不及标记定量法。要得到广泛的应用，非标记定量技术还需要进一步的优化和改进。

1.2.3 鸟枪蛋白质组学策略鸟枪法首先采用标记或非标记的方法将蛋白质混合物降解成肽段的混合物，利用质谱进行分析测序，然后利用计算机技术描绘出肽段在蛋白质上的位置图谱，从而确定该混合物中的蛋白质成分。其代表方法是MudPIT。

2 蛋白质组学在植物逆境生物学研究中的应用

自然界中有多种非生物和生物因子都会对植物的生长发育造成不利影响，严重时甚p

Ganmulla等[9]将24日龄水稻秧苗的叶片分别在5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）的低温和28 ℃（36 d）、36 ℃（44 d）的高温环境下处理3 d，并检测其蛋白质组变化。采用无标记的鸟枪法，对每个处理组的3个生物学重复进行了蛋白质定量分析。结果表明，在一个或多个处理组中被鉴定出来的蛋白，有超过400个都对温度胁迫进行了响应。其中，分别有43、126和47个蛋白专一地出现在了5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）和36 ℃（44 d）处理组中。并且，与其他温度处理相比，12 ℃（20 d）处理后的水稻叶片蛋白质组发生的变化更显著。另外，该试验还鉴定出了20个新的胁迫响应蛋白。