微生物塑料的可行性报告

微生物塑料的可行性报告

一、产品意义和社会效益

微生物塑料是近年来应用环境生物学方面研究的热点。这类塑料与传统的塑料相比具有许多优点:在生态环境中易被降解，不造成环境污染;在人体内可分解、代谢，不引起病变和中毒;可以再生，像一座“加工厂”一样可大量生产，不断扩大生产。用微生物生产生物降解塑料为人类解决全球白色污染问题找到了一条光明之路。

在众多的生物可降解塑料中，聚-β-羟基丁酸(简称PHB，

poly-β-hydroxybutyrate)便是其中较为重要并已经开始投放市场的一种。聚羟基丁酸酯(PHB)是微生物在不平衡生长条件下储存于细胞内的一种高分子聚合物，广泛存在于自然界许多原核生物中。

PHB具有完全的生物降解性、生物相容性、压电性和光学活性等优良特性，还具有类似于化学合成塑料(从聚丙烯到合成橡胶)的理化性质，能拉丝、压膜、注塑等，且无毒无害，最重要的是微生物塑料以生物资源为原料，取代了不可再生的化石资源，如石油和煤炭等，可以节约能源、保护环境，实现资源与环境的可持续发展。作为一种新颖的功能材料，PHB

可望在农业、食品、日用消费品、环保、电子、光学、生物医学等高技术领域中获得广泛应用。

二、国内外研究概况

1926年法国巴斯德研究所Lemoigne首次从巨大芽孢杆菌细胞中发现并

分离提取了PHB。英国帝国化学公司ICI是世界上最早商品化生产PHB 的厂家。1981年该公司采用真养产碱杆菌（A.eutrophus）的一个突变株，成功地运用单细胞蛋白的发酵装置，以糖和丙酸为主要碳源，首先生产出工业化商品PHBV，命名为Biopol。目前，美国、日本、意大利、西欧等许多国家，积极投入大量资金，鼓励对可降解塑料的开发研制。但由于商业竞争的原因，有关PHB发酵生产的关键技术的研究报导非常少。

国内对于采用微生物发酵法生产生物可降解塑料的研究起步较晚，但进步很快，取得了很大的成果。中科院微生物研究所陈琦等1994年报道通过紫外诱变A.eutrophus H16原始菌株选育出能利用葡萄糖发酵生产PHB的优良菌株65-7,47-5和34-5。清华大学生物系陈国强教授采用基因工程菌生产PHB产品已实现产业化，市场前景看好。目前国内从事PHB的研究主要单位有中科院微生物所、山东大学、无锡轻工业大学、北京农业大学等。

三、构建高产菌路线

现已在300多种细菌包括革兰氏阴性菌和阳性菌中发现PHB的合成，研究表明，合成PHB的微生物分布极为广泛，这些细菌包括光能和化能、自养和异养菌共计65个属中的近300种微生物。积累有PHB的微生物很容易通过苏丹黑或尼罗蓝染色来鉴别。目前研究较多的，用于合成PHB的微生物列于表1。

可见，能合成PHB的菌属是非常多的，不同的菌属对底物的要求、所

合成PHB的结构、产率甚至合成机制均有很大差别。它们分别利用不同的碳源产生不同的PHB，糖类、脂肪醇、脂肪酸、碳氢化合物甚至二氧化碳和氢气的混合气体都可作为碳源。尽管能产生PHB的菌株比较多，但只有具备下列优点的菌株才适用于工业生产PHB:利用廉价碳源的能力强;生长繁殖的速率高;合成多聚物的速率快;细胞内积累多聚物的浓度高。目前发现真养产碱杆菌是较能符合上述要求的菌种。

我们可以从真养产碱杆菌的一个菌株出发，经过诱变处理筛选出优良的突变株。

表1 能合成PHB的微生物

四、生产工艺流程

PHB在微生物细胞中的合成和分解过程如图1。

以真养产碱杆菌为代表的多数微生物，若从乙酰CoA出发，依次在酶①、②、③催化，经三步反应合成PHB。

当碳源过量，而氮、磷、镁或氧等其他营养条件不足时，真养产碱杆菌能在胞内积累大量的PHB。PHB主要作为碳源和能源的贮存物，或是作为胞内还原性物质及还原能力的一种贮备，当营养条件改善后，被酶

解利用。细胞积累PHB后，当其它生长条件恢复平衡而碳源和能源缺乏时，PHB就会被细胞作为碳源和能源利用，降解到诱导前的水平。PHB 的降解过程是在酶④、⑤、⑥、①作用下降解为乙酰CoA后进入TCA 循环，彻底氧化为CO2和H2O，为细胞提供生长所需的能量和合成细胞物质所需的前体，从而完成PHB在细胞中的循环。

由于PHB只在细胞内积累，要实现其最大生产，必须做到:尽可能提高细胞密度;保证高的细胞内积累量;缩短发酵周期以提高生产强度。

常用的发酵底物主要为C1一C6化合物，如简单糖类(如葡萄糖、蔗糖、木糖)、有机酸(如丙酸、丁酸、戊酸、乙酸、乳酸、唬拍酸、衣糠酸)、醇(如甲醇、乙醇、戊醇)以及烃等。

我们采用真养产碱杆菌H16作为出发菌株，用物理方法诱变筛选得到能利用葡萄糖高积累PHB的突变菌株，经过培养，提取胞内积累的PHB。

(1) 诱变处理

将稀释后的菌液，吸取相同量分别放入6个牛肉膏蛋白胨平板培养基，进行紫外线处理。紫外灯功率为15W,照射距离为30cm,照射时间分别为15s,30s,45s,60s,90s,120s,照射后先进行平板培养，然后在筛选培养基中培养。

图1 PHB在微生物细胞中的合成和分解

（2）分析方法

通过菌体干重的测定，选出一个最佳紫外线照射时间，在该时间内紫外线对菌种的致死率最小，且产PHB较多的菌株。最后经过单菌株纯化优选得到菌株。

（3）与亲本株的比较

在相同碳源（葡萄糖）等条件的培养下，比较诱变后所得的菌株产PHB 能力，以说明该突变株是生产PHB的优良菌株。同时在培养过程中探索培养基接种时间、接种量、pH值、温度、碳氮源浓度等因素对PHB 发酵过程的影响，得出最佳PHB摇瓶发酵条件。

（4）采用适合的发酵条件，合成PHB，及时停止发酵，使PHB积累量最多。

（5）PHB的提取：发酵液经预处理后，离心分离细胞，通过高压匀浆器使细胞破碎，再离心除去细胞碎片，然后通过离子交换和层析的方法使产品得以纯化。

生产流程为: A.eutrophus H16→紫外线处理→选出最佳突变株→在适宜的条件下（接种时间、接种量、pH值、温度、碳氮源浓度等）发酵→合成PHB→适时停止发酵→提取PHB。

五、产品的质量标准

目前国内评价降解塑料材料主要有以下测试技术和标准体系：