产蛋氨酸益生菌的筛选和鉴定

本较高；而大肠杆菌为致病Biblioteka Baidu，因此，蛋氨酸的应 用受到了很大限制。为了扩展蛋氨酸的应用范围， 我们从益生菌方面进行筛选，从谷物发酵食品和实 验室提供的菌种中分离纯化了 48 株菌株。采用高 效液相色谱测定各菌株发酵液中蛋氨酸的含量，筛 选出发酵液中蛋氨酸含量相对较高的 2 株菌，并利 用分子生物学技术对它们进行了鉴定，为高产蛋氨 酸益生菌菌种的选育与应用提供理论参考。
火温度为 50 ℃之外，其余同 1.3.1。
株，用“M”表示；以及实验室提供并分离的 7 株
2 结果与分析
菌。 2.2 菌种发酵液中蛋氨酸含量检测结果
2.1 菌种分离纯化的结果
2.2.1 蛋氨酸标准品衍生后液相图谱
本试验从发酵谷物和实验室提供的菌种中分离
采用高效液相色谱检测蛋氨酸标准品衍生液见
得到 48 株菌。其中大列巴中分离到 10 株，用“A” 图 1。
将分离得到的菌种分别单独接种至发酵培养
基中，30 ℃、120 r·min-1，摇床培养 48 h。取发酵 液 1 mL，按照 GB/T 18246-2000 酸水解法进行水 解[7]。水解后，抽真空，蒸发至干燥，用 2 mL 三 蒸水溶解，得到发酵样品液。 1.2.3 氨基酸的衍生
蛋氨酸标准品的衍生：衍生方法参见文献[8]， 按照 CDNB 理论值 5 倍量分别加入（CDNB=1.36）[9]， 用微型漩涡混合仪混匀，置 80 ℃恒温水浴锅中反 应 1 h，冷却后用 1 mol·L-1 盐酸调解 pH 7.0，配置 成 了 相 当 于 含 蛋 氨 酸 分 别 为 100， 80， 60， 40， 20，10，5 μg·mL-1 的标准衍生液。
采用平板划线法对所有样品中的细菌进行分 离[5]。取细菌悬液划平板接种于固态培养基中，培养 温度采用 25~37 ℃，培养时间为 2~3 d 后，挑各种 不同单个菌落接至液态培养基，培养基变浑浊后又 接至固态培养基，如此反复至平板中菌落单一。挑 出单一菌落，革兰氏染色，镜检，并于-80 ℃冻存[6]。 1.2.2 发酵样品液的制备
Laboratory of Dairy S cience , Minis try of Education, Food College , Northeas t Agricultural Univer-
s ity, Harbin 150030, China )
Abstract: The characteristic of probiotics with methionine production ability is advantage to the
development and utilization of probiotics fermented food. In this study, 48 strains were isolated from the dough of fermented food, rice wine, distilled spirit and laboratory strains. After these strains were purified and cultivated, the methionine content of the fermented broths of each strain was detected by the HPLC, two strains with high methionine production ability were determined. Then by 16S rDNA sequence amplification, blast analysis and specific PCR, two strains were identified as bacillus natto and bacillus subtilis, the content of menthionine in the fermentation broths of them was 21.08 and 19.38 g·L-1, respectively.
PCR 等技术鉴定这 2 株菌，分别为纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp）. ，两株菌
发酵液中蛋氨酸分别为 21.08、19.38 g·L-1。
关键词：发酵食品；蛋氨酸；益生菌；高效液相色谱；16S rDNA；特异 PCR
中图分类号：TS26
第6期
于 微等：产蛋氨酸益生菌的筛选和鉴定
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1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 菌株筛选的原料
面包、麻花、大列巴、馒头、发面饼等发酵 谷物的酸面团，米酒、白酒曲等购于哈尔滨市香 坊农贸市场。 1.1.2 实验室提供的菌株
菌株 KLDS4.0604、KLDS1.0342、KLDS1.9201、 KLDS1.1086、 KLDS1.1025、 KLDS1.1625 和 KLDS 10.0353 均由乳品科学教育部重点实验室提供。 1.1.3 培养基
DNA 提取试剂盒，琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂 盒（均为天根试剂公司，中国北京）；L-蛋氨酸标 准品（色谱纯）；0.5 mol·L-1 Na2CO3-NaHCO3 缓冲液 （pH 9.0）；含 φ＝30％乙腈的 0.01 mol·L-1 NaAC 缓 冲液（pH 6.4）；30 mg·mL-1 CDNB（2，4－二硝基氯 苯溶液）溶液，现用现配。 1.2 试验方法 1.2.1 菌种分离纯化方法
3.499 5.610
峰高（mV） Peak height
0.20
0.15
0.10
9.657
2.333 2.850
3.128 4.579 5.911
0.05
0
荭荭荭荭◇ 荭 荭荭 荭◇荭
荭荭
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00
Key words: fermented food; methionine; probiotics; HPLC; 16S rDNA; specific PCR
益生菌可维持肠道的菌群平衡，抑制病原菌的 生长，有益于人体健康[1]。蛋氨酸是人和动物体内 具有重要生理作用的限制性必需氨基酸，对机体正 常生长发育、新陈代谢具有重要作用，可促进脂肪 分解，抑制肝脏中脂肪的堆积[2]。目前，微生物发 酵法生产蛋氨酸，采用的菌种主要是谷氨酸棒状 杆 菌（Corynebacterium glutamicum）和 大 肠 杆 菌（E. coli）[3]。前者是具有重要经济价值的菌株[4]，生产成
5'CGGTCGTAAACGCACTATCA 3'，5'CCTTCAATGT 离到 7 株，用“O”表示；麻花中分离到 3 株，用
AAATCGGCTCT 3'。分别对这两株菌株进行 PCR “T”表示；发面饼中分离到 4 株，用“F”表示；白
扩增，PCR 体系同 1.3.1，反应条件除两株菌的退 酒曲中分离到 5 株，用“B”表示；米酒中分离到 4
麦芽汁培养基：稀释麦芽汁到 10～12 波美度。 固态培养基加 1.5%~2.0%的琼脂。 1.1.4 仪器
高效液相色谱仪（HPLC）（购自美国 Waters2695）；紫外检测器（购自美国 Waters2487）；C18 不 锈钢分离柱 YMC（5 μm×4.6 mm×150 mm）。 1.1.5 试剂
根据 16S rDNA 分析结果，分别根据纳豆芽孢 杆菌和枯草芽孢杆菌的基因序列设计特异性引物进 行 PCR 扩增，其中纳豆芽孢杆菌的特异性引物为 5'CGGTCGTAAACGCACTATCA 3'，5'CCTTCAATGT
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东北农业大学学报
第 41 卷
AAATCGGCTCT 3'；枯草芽孢杆菌的特异性引物为 表示；馒头中分离到 8 株，用“X”表示；面包中分
文献标志码：A
文章编号：1005-9369（2010）06－0122－05
Screening and identification of probiotics with methionin production ability/YU Wei, GAO Xuejun, LUO Chaochao, WANG Qingzu, LU Zhiyong, QIAO Bin (Key
发酵样品液的衍生：取发酵样品液 1 mL，分 别加入 CDNB 溶液 1.5 mL，其他步骤同上。 1.2.4 色谱条件
流动相：取 0.01 mol·L-1 pH6.4 NaAC 缓冲液 700 、300 mL 色谱级乙腈混合；检测波长：350 nm； 柱 温 ： 38 ℃ ； 流 速 ： 1.0 mL·min -1； 进 样 量：10 μL；衍生后的试剂经 0.22 μm 膜过滤后 进样。 1.3 菌种的鉴定 1.3.1 16S rDNA 分析
时间（min）Time
图 1 40 mg·mL－1 标准品衍生液液相色谱
Fig. 1 HPLC result of standard derived liquid of 40 mg·mL－1
收稿日期：2010-03-18 基金项目：黑龙江省科技计划项目（GAO7B401-5）；哈尔滨市科技创新人才研究专项基金项目（RC2008XK002010） 作者简介：于微（1982－），女，研习员，硕士研究生，研究方向为益生菌。E-mail: yuwei_www@163. com * 通讯作者：高学军，教授，博士生导师，研究方向为分子生物学。E-mail: gaoxj5390@sina. com
摘 要：由于益生菌产蛋氨酸的特性有利于益生菌发酵食品的开发利用，从发酵食品的酸面团、米酒、白酒
曲，以及实验室提供的菌种中分离纯化出 48 株菌株。将这些菌株进行纯化培养，利用高效液相色谱检测各菌株
发酵液中蛋氨酸的含量，筛选出蛋氨酸含量相对较高的 2 株菌。利用 16S rDNA 扩增及 Blast 分析、特异性引物
对筛选出高产蛋氨酸的菌种进行 16S rDNA 分 析。首先用细菌基因组 DNA 提取试剂盒（天根试剂 公司，中国北京）提取所选菌种的 DNA，然后用通 用细菌引物，正向引物 Primer A：5'AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG 3'； 反 向 引 物 Primer B： 5'AAGG AGGTG ATCCAGCCGCA 3' 进行 PCR 扩增[10]。PCR 体系：25 μL 体系，10×TaqEx Buffer 2.5 μL，dNTP MTxture 2.0 μL，模板 DNA 1.0 μL，引物 1 为 1 μL， 引物 2 为 1 μL，TaqEx 0.25 μL，灭菌蒸馏水 17.25 μL。反应条件：94 ℃预变性 5min、再 94 ℃变性 30 s、63 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 1 min 并循环 30 次，最后 72 ℃终延伸 10 min。扩增产物用 1%的 琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖凝胶 DNA 回收 试剂盒（天根试剂公司，中国北京） 回收，回收产 物送去测序（本实验引物合成及测序均在上海英俊 生物科技有限公司进行）。 1.3.2 特异性引物 PCR 分析
第 41 卷 第 6 期 2010 年 6 月
东北农业大学学报 Journal of Northeast Agricultural University
41(6): 122~126 June 2010
产蛋氨酸益生菌的筛选和鉴定
于 微，高学军*，骆超超，王青竹，卢志勇，乔 彬
（乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）
基础培养基：葡萄糖 5 g、酵母膏 5 g、蛋白 胨 10 g、NaCl 2.5 g，加蒸馏水配至 1 L，pH 调至 7.2～7.4。固态培养基每升加琼脂 15～20 g·L-1。
发酵培养基：葡萄糖 15.0 g、（NH4）2SO4 3.5 g、 CaCO3 4.0 g、 MgSO4·7H2O 0.02 g、 K2HPO4· 3H2O 0.15 g， 玉 米 浆 2.5 g， 蒸 馏 水 100 mL， pH7.0～7.2。