冷冻干燥中冻干制剂的一些问题综述讲解

冷冻干燥中冻干制剂的一些问题综述综述
2013.6 陈亚飞
摘要：冷冻干燥技术是生物制剂的主要生产工艺，采用冷冻干燥工艺可保持产品原有的理化性质和生物活性，且有效成分损失极少。

干燥后的产品形状、体积、晶型等理化指标均一性好。

产品因含水量低而易于长期保存, 因疏松多孔而使得加水后可迅速完全溶解。

但在冻干制剂的生产或实验中我们总会有一些冻干上的问题，下文就是我们在冻干制剂上的主要问题的分析。

关键词：制剂预冻共晶温度玻璃态转化崩解温度干燥稳定性水分保护剂一冷冻干燥技术
1 冷冻干燥技术的发展
随着真空泵和制冷机的出现，冷冻和干燥理念的结合，近些年来冷冻干燥技术在全世界发展迅速，应用非常广泛。

冷冻干燥技术的发展史已经百年有余，从最初发现冷冻干燥技术，以及真空条件下水的饱和蒸汽压于水的温度关系，到采用主动加热方法减短干燥时间并用于生产化。

1958年的第一届冷冻干燥会议促进了冻干的发展，在食品、药品、建材等行业得到广泛应用。

近些年来，伴随着电子计算机和传感测量技术在冻干领域的应用，冻干技术已加入高新技术领域行列。

人体器官的保存和再植的研究，营养保健食品的追求，超轻隔热陶瓷在航天飞机的应用，以及低温超导材料等纳米级超细微粉材料的制备，都需要真空冷冻干燥技术和设备。

在医药领域中，真空冷冻干燥技术对药品和医疗事业都有重要应用。

药品方面上包括生物制品（活菌菌苗、活毒疫苗、一些生物制品和生化药品等）、化药生产（多位注射剂：抗生素药、循环器官用药、中枢神经用药、维生素类和肿瘤用药等）、中药生产（中草药、中成药）；医疗事业上对保存血液、动脉、骨骼、皮肤、角膜和神经组织等各种器官上效果良好。

2 冷冻干燥的定义及优缺点简述
冷冻干燥是指将被干燥含水物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用水的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥目的的一种干燥方法。

是将热能通过与物料接触的壁面以传导方式传给物料，使物料中的湿分气化并由周围空气气流带走而干燥的操作。

冷冻干燥过程物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔在升华时要吸收热量。

升华吸收热量会引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热，整个干燥是在较低的温度下进行的。

冻干有很多优点，
低温低压下许多热敏性的物质像蛋白质、微生物之类不会发生变性或失活，微生物的生长和酶的作用无法进行，可保持原来的性状，真空下氧气极少，易氧化的物质得到了保护。

干燥能排除95-99%以上的水分，使干燥后产品能长期保存而不致变质。

在低温下干燥时，物质中的一些挥发性成分损失很小，干燥后的物质呈海绵状疏松多孔，加水后速溶完全，几乎立即性状复原。

冻结状态进行干燥可使体积几乎不变，结构不变，不浓缩，原本的溶解物质在物料中分配均匀且升华不析出，防止表面硬化。

冻干过程污染机会少，易实现无菌操作。

冻干有几点缺点：溶剂不能随意的选择，特殊晶型制备很困难，一些产品复溶会混浊，冻干时间长成本高。

3 冷冻干燥的原理介绍
水分在物料中存在有两种方式，一种是游离水（自由水），冷冻干燥中的主要对象，自由水与物料主要以吸附和渗透的形式结合，大量存在与物料的表面、毛细管、孔隙中，冻干时稍低于0℃就结冰，以升华的方式被除去。

另一种是结合水，以化学结合水形式存在于物料的组织中，结合力强，在-50℃到-60℃条件下才能冻结，一半在冻干后期，随温度的增加以蒸发的形式被除去。

升华过程可用水的三相图图1来说明，水在不同的温度和压力下，以气态、液态或固态存在。

在相图上，三相点O点以上，可能以固、液、汽三态之一的状态存在，而在三相点以下，只有固汽两相。

水的三相点参数为温度0．01℃，压力610 Pa。

在610 Pa以下给冰加热，就可直接升华为水蒸汽。

纯水可在0℃固化结晶，各种物料中的液体却是含有不同溶质的水溶液，其冻结温度各不相同，物料中水溶液完全冻结的温度为其共晶温度。

不同物质或同一物质含水量不同时其共晶温度也各有不同，需经实验得出。

图1水的三相图及产品冻干后结构图
二预冻条件的优化
预冻过程在很大程度上决定了干燥过程的快慢和冻干产品的质量，产品预冻的效果由三个参数确定:预冻最低温度、预冻速率和预冻时间。

预冻条件的优化需要我们做到针对自己使用的冻干机性能和三个参数优化中找到适合的条件。

1 预冻最低温度的确定
目前，在预冻温度的确定上很多生产厂家和实验部门没有给予足够重视，随着冻干生产量的不断扩大，盲目的深度预冻将造成能源的浪费和升华干燥时间的消耗。

预冻温度和共晶温度密切相关，我们熟知纯水可在0℃固化结晶，但各种物料中的液体却是含有不同溶质的水溶液，其冻结温度各不相同，物料中水溶液完全冻结的温度为其共晶温度（Te，共熔点）。

不同物质或者同一物质含水量不同时其Te各有不同。

纯水没有带电离子是不导电的，含有物料的溶液中有带电离子，当物料中水分被冻结，带电离子也会被固定住，导电能力急剧下降，物料的电阻也急剧增加。

根据此原理，利用Te的测定设备测定物料降温冻结过程中与冻结后的物料升温融化过程中电阻值的变化最剧烈时对应的温度就是物料的Te。

此设备包括万用表、铜电极、物料池、热电阻、温度显示仪五个部件，如今市场上已有代测共晶温度或出售测量设备的卖家。

一般预冻结温度比Te低8℃～10℃就可以，保险起见可以比Te低15℃就应该没问题。

多数产品的Te在-15℃～-25℃之间，若没有条件知道产品Te，一般预冻最低温度定在-40℃～-35℃比较合适。

对于瓶装产品，小瓶在温度剧变时可能会发生掉底现象，我们曾做过一组预冻试验, 在其它条件完全相同的前提下, 倒锅底形“˄”凹底小瓶几乎无掉底现象, 圆弧“∩”凹底小瓶掉底现象明显增多, 而平底“-”小瓶则掉底严重。

所以选瓶时应试验瓶底对冷冻温度的耐受程度, 选择最适宜的温度, 以免造成损失。

2 选择适宜的预冻速率
冷冻时形成的冰晶大小会影响干燥速率和干燥后产品的溶解速度，我们必须要根据产品的不同经试验得出一个最佳的冷冻速率。

通常介绍冻干理论的书籍都会提到，降温速率越大，溶液的过冷度和过饱和度愈大，临界结晶的粒度则愈小，成核速度越快，容易形成颗粒较多尺寸较小的细冰晶。

因而冰晶升华后，物料内形成的孔隙尺寸较小，干燥速率低，但干后复水性好，这就是快冻；相反，慢速冻结容易形成大颗粒的冰晶,冰晶升华后形成的水气逸出通道尺寸较大，有利于
提高干燥速率，但冻干后复水性差。

有人曾经质疑过这条理论是在受热均匀的前提下得出来的，比较理想，而生产中和实验中的冻干机所提到的冻干条件没有那么理想，在丁香园论坛上看到一位叫tinybayonet的说法，他把快冻慢冻分为以下几类：1）、板温降得较快，且板温比产品温度低很多，则制品底部先冻结产生结晶，但上部液体仍较热，所以不至于瞬间全部结晶，结晶会缓慢生长，就得到了慢冻的效果。

2）、板温降得较慢，板温与品温相差不大，则制品整体均匀降温，并形成过冷，当能量积累足够时，瞬间全部结晶，得到了快冻的效果。

3）、板温降得很慢，并在低于共熔点的适宜温度保持（或缓慢降温），则制品形成较小的过冷度，液体中先出现少量结晶，继续降温结晶生长，得到大结晶，这即是真正的慢冻。

4）、制品浸入超低温环境（如液氮），整体瞬间结晶，形成极细小的晶体（或处于无定形态），这即是真正的快冻。

我比较赞同他的观点，企业在大多数情况下采用瓶冻的冻干方法的，瓶冻的受热不均匀现象很明显。

样品进入冻干箱前的温度越高，样料液上下部分的温度梯度越大，冰晶生长速度越慢。

溶液若慢速降温，则形成冰晶比较粗大，冰界面由下向上推进的速度慢，溶液中溶质迁移时间充足，溶液表面冻结层溶质积聚也就多。

因而导致上表层的溶质往往较多，密度较高，而下底层密度较小，结构疏松。

同时，在不同的预冻温度下冻结的样品，干燥后支架孔径大小有明显差异。

预冻温度愈低，支架孔隙直径愈小。

这种分层现象又叫溶质效应，在骨架差的制品上体现得最为明显，或者底部萎缩，或者中间断层，或者顶部突起，或者顶部脱落一层硬壳，不一而足。

溶质效应是由于水的冻结使间隙液体逐渐浓缩，从而使电解质浓度增加，引起蛋白质的变性和细胞脱水，导致细胞死亡。

溶质效应在水的冰点和共晶点之间这一温度范围最为明显。

若能以较高的冷冻速度越过这一范围,则可大大削弱溶质效应。

在实践中，也有人提倡使用三步法，即将样品从室温先冷却至样品的初始冻结温度；停止降温过程，使样品内温度自动平衡，消除其内的温度梯度；然后再迅速降温，由于此时样品整体温度离结晶温度较近，且样品在冻结过程中，样品温度下降较慢，故样品在冻结过程中温度梯度会相对较小，冰晶生长速度必相对较快。

如此，便提高了预冻速率，解决了溶质聚集在上层的问题。

不过，并不是所有的品种使用了三步法后都能取得明显效果的。

3 预冻时间该如何确定
适宜的预冻时间可确保抽真空之前所有的产品均已冻实，以不致因抽真空而喷瓶为前提。

由于物体的传热为先表层后内部，冻干箱内的产品不可避免地存在一定的温度梯度, 这就需要依靠相应的保温时间和改善传热效率来缩小温度差异。

将盘装冻干改成抽底盘冻干，让玻璃瓶直接与板层接触，不失为改善传热的好办法。

多次试验表明，采用抽底冻干，产品温度下降明显增快，在样品达到预冻最低温度后，保温1～1.5小时即可。

目前实验室冻干机可以采用抽底冻干方法，但生产用的大型冻干机大多数还没有采用这种方法，保温时间要在2～4h。

三干燥阶段
1 干燥阶段条件
升华干燥的时间长短与产品的品种及分装的厚度以及升华时提供的热量有关，在产品品种及分装厚度已定的情况下，若要缩短时间，保证质量，就必须从加速热量传递着手。

冻干箱的板层是产品获得热量的来源，而箱体内的压强则是产品获得热量的环境条件。

长期以来, 由于国产冻干机的性能较差，各企业间又缺少相互交流，总以为冻干箱内的压强越低越好，其实并非如此。

压强低当然有利于产品内冰的升华，但若压强过低，则对传热不利，产品不易获得热量，升华速率反而降低。

而当压强过高时，产品内冰的升华速度减慢，产品吸收热量将减少，于是产品自身的温度上升，当高于共溶点温度时，产品将发生溶化造成冻干失败。

那么什么样的压强较合适呢，经验证明，冻干箱的压强在10 ～30Pa 时，既有利于热量的传递，又利于升华的进行。

而要将压强严格控制在这个范围之内，没有好的冻干设备是不行的。

目前国产冻干机多数没有此控制装置，加上控制检测仪表的灵敏度较差，使升华速度受到很大影响，所以若使用国产冻干设备，必须将各主要部件进行适当地调整改进，并增加真空控制装置，这样将大大缩短升华时间。

在解吸阶段，产品内冻结冰已不存在，因而可以将产品温度迅速上升到设定的最高温度，这样既有利于降低产品的残余水份，也可以缩短解吸干燥时间。

从理论上讲，一旦产品内冻结冰升华完毕，产品的干燥便进入了解吸阶段，而在实际操作中，如何界定产品的两个干燥过程, 则很难把握。

另外，在什么时候迅速提高产品温度, 对玻瓶的影响最小，也应加以考虑。

经过多次试验探讨之后, 我们基本可以认定，正常情况下，产品在到达0℃时已进入了解吸干燥阶段；而在0℃
以上时即使温度迅速上升，对玻瓶的影响也相对较小。

为了确保冻干产品质量，在冻干全过程运行即将结束前进行压力升高试验是很有必要的。

具体方法是：关闭冻干箱和冷凝器之间的阀门，注意观察冻干箱压力升高的情况，如果冻干箱内的压力无明显升高，说明干燥已基本完成，冻干可以结束；如果压力明显上升，则说明还有水份逸出，还需继续进行干燥，直至再次试验时，压力无明显上升为止。

一般在关阀后30～60 秒内，压力上升不超过3～8Pa，此时产品含水率通常约在0.4%～2%之间。

在产品出箱前，箱内温度最好回复到室温，这样可避免产品出箱后冷却吸湿，另一方面也不会对房间温度造成大的波动。

2 干燥阶段的水分控制
干燥过程对水分的控制是保证冻干制剂质量的关键，说到水分控制我们必须先引入玻璃态转化温度（Tg）的概念，有些液体非晶态物料在被冷却固化过程中不经过相变，而是连续地固化成玻璃体，这个过程称为玻璃化转变，所对应的温度称为Tg。

当物料到达这一温度时，很小的温度就可能引起冷冻浓缩液黏度的显著增加，同时冰的结晶停止。

无论是第一、第二干燥阶段还是贮存中的制剂温度都必须控制在Tg以下，否则冷冻浓缩液将会发生流动，破坏了冷冻建立起来的微细结构，就会发生塌陷。

对于冻干制剂药品水分含量的控制，水分含量越低，其Tg越高，药品越能长期稳定地储存，通常冻干制剂的水分含量要求控制在1％～3％之间，以保持稳定。

用动力学方程计算可以选择冻干终产品更合适的水分含量，既能满足药品在保存期稳定的要求．又避免在生产中因过度干燥而引起能源浪费。

另外，有研究表明瓶子的胶塞氯丁基橡胶塞要比溴丁基橡胶塞对水分的透过率高，故除了要选择适宜的湿度环境保存，也要选择合适的包装材料。

冻干制剂在一次干燥后往往都要进行二次干燥，二次干燥又叫解析干燥，主要干燥一次干燥残留的一些未被冻结的吸附水和结合水，这些靠升华无法去除的水分要靠蒸发来去除，这部分水分一定量时会为微生物生长和某些化学反应的进行提供了条件，所以必须得到去除。

最终冻干制剂含水量偏高主要原因 1）解析干燥时间太短，干燥温度太低；2）干燥层和瓶塞的流动阻力太大，半压塞太深，水蒸气不易析出。

3）装量太厚，一般是10-15mm，不宜超过15mm。

4）产品贮存期间，水蒸气通过瓶塞等包装不密封处进入。

3 干燥阶段塌陷（崩解）温度(Tc)
冻干产品在升华干燥阶段，随着升华时间的增长，产品中会出现已干层和冻结层，这两层之间的交界面是升华面，随着升华的进行，升华界面不断向减小冻结层方向移动，干燥层厚度逐渐增加。

已干层产品结构应该是疏松多孔的，并保持在稳定状态，以便冻结层升华出来的水蒸气顺利通过，是全部产品都能干燥良好。

但某些已干燥的产品当温度升高到某一数值时，会失去刚性，变成粘性，发生类似塌方的崩解现象，使干燥产品失去疏松多孔的状态，堵塞了冻结层产品水蒸气升华逸出的通路，妨碍了升华的继续进行。

于是升华速率变慢，由搁板供给冻结层的热量将有剩余，引起冻结层产品温度上升，当温度上升到共晶点温度以上时，产品就会发生熔化或产生发泡现象，致使冻干失败，这时的温度叫崩解温度。

有些产品的崩解温度高于共晶点温度，升华时只需要控制产品温度稍低于共晶点温度即可；有些产品的崩解温度低于共晶点温度，这样的产品应以控制崩解温度为准，在较低的温度下升华，势必要延长干燥时间。

产品的崩解温度取决于产品本身的物性和保护剂的种类。

混合物的崩解温度取决于各组分的崩解温度。

因此在选择产品的冻干保护剂时，应该选择具有较高崩解温度的材料，使升华干燥能在不太低的温度下进行，以节省冻干时间和能耗，提高生产率，降低成本。

产品的崩解温度不好测，只有在冷冻干燥显微镜下直接观察得知，表1给出一些物质的崩解温度值。

表1 一些物质的崩解温度
上面我们共提到的温度点有共晶温度、崩解温度和玻璃态转化温度。

一般来说，崩解温度Tc比共晶温度Te稍高，也有少数产品崩解温度Tc比共晶温度Te低。

共晶温度Te比玻璃转化温度Tg高。

一般Tc要比Tg高20K左右。

DSC是传统的测定Te 和Tg的方法，迅速、精确、样品用量少、灵敏度高。

Tc只能通过冻干显微镜测得。

值得注意的是，有些物料没有或不需要研究Tg，有些物料没有Tc。

这几个温度参数只与物料的成分、性质和加入的添加剂成分、性质有关，受工艺过程参数影响不大。

对于具体物料，如果查不到需要的有关数据，这时测试相关的参数是有必要的，而研究这些参数的测试方法和测试结果的正确性是很重要的。

四冻干辅料探究
1 冻干溶剂
冻干的常用辅料包括溶剂和冻干保护剂，在说到冻干保护剂前，先了解一下溶剂，常用溶剂包括注射用水、乙醇、丙二醇、正丁醇、异丙醇、叔丁醇、聚乙二醇。

拿冻干粉针剂来说，冻干粉针剂的药物和所使用的各种辅料必须有极高的纯度，且无微生物污染和毒性成分。

注射剂溶剂首选注射用水，当注射用水不能满足药物性质和临床要求时，才会考虑其他非水溶剂。

其中在冷冻干燥中常见的有机溶剂是叔丁醇。

在有机混合溶剂存在下，增加了低压冷冻干燥时药物的稳定性，提高升华速率和缩短冻干时间等。

由于非水溶剂的刺激性和毒性，通常采用一种或几种非水溶剂和注射用水的混合溶剂。

乙醇作为溶剂浓度可高达50%；丙二醇作为溶剂比甘油更好，溶解性也好，还可作为渗透性保护剂；聚乙二醇在制剂中应用广泛。

我们主要来研究一下叔丁醇，叔丁醇在冷冻干燥中采用叔丁醇和水的系统（3%-19%的叔丁醇）为溶剂，可改变晶体特性，形成针状冰晶，提高干燥效率，缩短干燥时间。

叔丁醇作为冻干溶剂还有一个独特的优点，其溶剂自身在冻结中形成针状结晶，能改变溶质的结晶方式，利于升华。

而当少量的叔丁醇加入到水中形成叔丁醇-水共溶剂后，在可以改变水的结晶状态，在冻结过程中形成针状结晶，具有更大的表面积, 同时冰晶升华后，留下了管状通道，使水蒸汽流动阻力大大减小，升华速率显著提高，因此可用叔丁醇来加快冷冻干燥过程中的传质过程。

叔丁醇可以单独使用，也可以与水任意比混合形成共溶剂体系进行冻干。

单独使用时溶解水不溶性药物或水中稳定性不好的药物。

另外有研究以叔丁醇作
为溶剂溶解磷脂，经冻干后得到结构酥松的磷脂固体，加入水可以迅速水化制成脂质体。

这种方法类似薄膜分散法，可以制得粒径较大的微米级多室脂质体，这种脂质体制备工艺已经应用于试验和规模生产。

目前更多是叔丁醇与水形成共溶剂体系进行冷冻干燥的研究，其在药剂领域中应用总结起来主要在固体制剂（难溶于水的药物溶于叔丁醇中，水溶性物质溶解于水中，两者以适当的比例混合，得到可以共同溶解水溶性与脂溶性物质的澄明共溶剂，此溶液经进一步冻干可以得到固体分散体。

可加快药物升华速度，缩短冻干周期，提高药物稳定性，增溶难溶性药物，简化制备固体分散体工艺，促进药物的结晶。

）、分散体系（脂质体制备、非离子表面活性剂囊泡的制备、高聚物胶团的制备等）、工艺路线改进（蛋白质-多肽的磷脂分散体的制备、难溶性药物在水中的溶解度等）三个方面。

理想的冻干溶剂需要如下条件：凝固点高、挥发性强、最好能与水混溶。

众多有机溶剂中，叔丁醇被认为是最适合的冻干溶剂，主要原因如下：①凝固点高，纯的叔丁醇在室温下（25 ℃）就可以冻结，与水混合后也可以在零下几度冻结，在现有的冻干机中都可以完全冻结。

其他的一些有机溶剂如乙醇等凝固点低，一般都在零下几十度才能冻结，一般的冻干机无法将其冻结捕获，最终都进入到真空泵中，因而在实际生产中无法使用。

②叔丁醇的蒸汽压较高，蒸汽压高有利于升华，节省冻干时间，而另一种有机溶剂二甲基亚砜, 尽管凝固点在18.4 ℃，但蒸汽压较低，升华困难，很难用于冻干。

③叔丁醇与水可以任意比例混合，这点也很重要，可以增大一些脂溶性药物在水中的溶解度，同时对一些水溶液中不稳定的药物，加入适量的叔丁醇可以抑制药物的分解，增强药物的稳定性。

而环己烷虽然在室温条件下也可以冻结（6.5 ℃），但几乎与水不互溶，只能用于脂溶性药物，极大的限制了它的应用范围。

④叔丁醇毒性低，作为药用的辅料，叔丁醇的毒性很低，在冻干过程中，大部分叔丁醇可在一次干燥阶段升华，在制剂中残留量很低，可以安全的用于制剂生产中。

采用叔丁醇-水共溶剂为溶剂进行冷冻干燥的工艺可以用于多种制剂的制备，在很多方面具有优势。

对这项技术进行深入研究，对药剂学基础理论和实际应用具有重要的意义。

2 冻干保护剂
加入冻干保护剂的目的是为了提高冻干产品的质量：赋形剂，可使固体物质的质量分数在4%-25%之间，冻干后形成疏松团块结构；胶状物质可防止冻结前溶。