常用细菌检测方法

常用细菌检测方法
一、[3H]脱氧胸苷摄入法测定细胞数：
1、用RPMI-1640培养液洗涤对数生长期（培养3天）的CTLL-2细胞两次，每次250×g离心10分钟，洗去培养液中残存的IL-2。

2、用台盼蓝（1%Trypan blue）染色法计数细胞并决定细胞的活力，用10%小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞至1×105/ml。

3、在96孔细胞培养板中每孔加0.1ml倍比稀释的标准IL-2或待测样品，每个稀释度三个复孔，标准IL-2从40IU/ml稀释到0.019IU/ml（8～10个稀释度），阴性对照孔不加IL-2。

4、每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养18～24小时。

每孔加10μl（0.5μCi或1.85×104Bq）[3H]脱氧胸苷，继续培养4小时。

5、用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用3%醋酸水溶液滤纸3次，洗去游离的[3H]TdR。

将滤纸置液体闪烁瓶中，加入5ml闪烁液。

在液体闪烁仪上计数细胞摄入的同位素活性（每分钟放射性计数，cpm），根据仪器效率换算成dpm（每分钟衰变数）。

6、用dpm值对样品稀释倍数作图。

在图上，标准IL-2的曲线与待测样品的曲线应当呈平行的S型，说明是同样的分子反应。

比较同样dpm处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。

二、MTT检测法：
1、取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），在37℃5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）
2、用RPMI-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。

对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。

在37℃5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时间。

3、吸去培养液，用PBS洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。

中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载体，致力于搭建产研结合的桥梁。

以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推动化工行业的发展。

4、每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6小时。

5、每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10%SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。

置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长570nm，参考波长630nm。

以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。

三、XTT检测法：
用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤，XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物（formazan）。

代谢产物在OD450处有吸收峰。

四、MTS检测法：
1、培养IL-2依赖细胞株CTLL-2细胞或HT-2细胞（检测IL-2），或者IL-3依赖细胞株FDC-P1细胞或FL5.12细胞（检测IL-3）到对数生长期。

2、取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1×104～2×104上述细胞之一的DMEM培养液（加10%小牛血清）。

3、每孔加0.1ml系列稀释的待测细胞因子（IL-2或IL-3）样品或细胞因子标准品，在37℃5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。

4、每孔加20μl MTS/PMS混合液，继续培养3～4小时显色。

5、检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。

在酶联检测仪上，波长570nm（或490nm，或570nm 和690nm）处检测各孔的光吸收值（OD）。

用样品稀释度对OD值（OD570、OD490或OD570/OD690）绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。

五、NAG检测法：
1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。

2、吸去培养液，用PBS洗涤两次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前先离心）。

3、每孔加60μl NAG染液，在37℃5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。

4、每孔加90μl终止液，混匀后置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长402nm。

以OD 值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。

中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载体，致力于搭建产研结合的桥梁。

以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推动化工行业的发展。

六、AlamarBlueTM摄入法：
1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。

2、在培养结束前24小时加入Alamar Blue染料，96孔细胞培养板每孔20μl。

3、在培养结束后，直接在酶联检测仪上测定光吸收值。

氧化型Alamar Blue的最大光吸收在570nm，用OD570减去OD600即为活细胞还原的Alamar Blue染料，颜色深浅与活细胞数成正比。

七、碱性磷酸酶检测法（AKP法）：
1、按MTT法用细胞因子处理靶细胞适当时间，用PBS洗去死亡细胞，洗两次。

2、向96孔细胞培养板各孔中加0.2ml新鲜配制的底物液（0.2mol/L硼酸，1mmol/L MgCl2，1.2mmol/L甲伞基磷酸）。

在37℃5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养3小时。

3、在荧光计数仪上测定荧光的量。

根据测定已知不同数目细胞的荧光量作出标准曲线，根据标准曲线可得到各孔中的活细胞数。

八、三磷酸腺苷检测法（ATP法）：
1、ATP反应液（Bio-Orbit）是粉末状混合物，含有荧光素、荧光素酶、0.5mmol醋酸镁、50mg BSA和0.1μmol无机焦磷酸。

在4℃可以保存1个月。

用前用10ml含2mmol/L EDTA的0.1mol/L pH7.75Tris-醋酸缓冲液稀释。

稀释液分装后可在－20℃长期保存。

2、在已经完成促增殖或抑生长试验后的96孔细胞培养板中（每孔含100μL细胞培养液），每孔加0.1ml ATP释放因子，室温中反应5分钟。

取另一块96孔细胞培养板，从第一块板的各孔中吸0.1ml细胞溶解物到第二块板的相应各孔。

3、在低于25℃中，将第二块板置自动多孔荧光检测仪中。

用自动加样器，每孔加入20μl ATP 反应液，立即检测10秒钟的荧光强度。

温度升高，检测敏感性就下降。

4、用RLU（Y轴）对细胞因子标准品的稀释度（X轴）作标准曲线，根据标准曲线确定待测样品中细胞因子的含量。

九、染料染色法测定细胞数：
1）结晶紫检测法：
1、在96孔细胞培养板各孔中加0.1ml含5×104～10×4WEHI-164细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），37℃5%CO2的二氧化碳培养箱中培养2～3小时，让细胞帖壁。

中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载体，致力于搭建产研结合的桥梁。

以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推动化工行业的发展。

2、用RPMI-1640培养液10倍递次稀释TNF标准品，根据需要3～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3个重复孔。

对照孔6个，3个阳性对照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。

继续培养18～24小时。

3、甩去培养液，用PBS小心洗涤一次，每孔加0.1ml10%甲醇溶液固定细胞30秒钟。

4、吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml结晶紫染液，室温中放置20分钟。

5、轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。

自然干燥或37℃烘干。

此板可以在室温中长期保存。

6、测定前，每孔加0.1ml33%醋酸脱色，充分振荡后在570nm处测定光吸收度。

用光吸收度（OD）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性2）NBB检测法：
1、在用细胞因子处理靶细胞以后倾去培养液，倒置培养板于吸水纸上吸干培养液。

再用100μl磷酸缓冲盐水小心洗去死细胞，用吸水纸吸干培养液。

2、每孔加100μl NBB染液，室温中染色30分钟。

轻轻染液。

用吸水纸吸干染液。

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3、每孔加100μl福尔马林固定液固定15分钟。

用自来水轻轻洗去固定液，倒置培养板，用吸水纸吸干染液。

4、每孔加150μl50mmol/L氢氧化钠。

轻轻振荡培养板直到染料全部溶解并均匀分布。

在分光光度计上读取各孔在620nm处的光密度（OD）值。

计算TNF的活性。

3）美蓝染色检测法：
1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μL细胞培养液的检测孔中，每孔加0.02ml25%戊二醛固定活细胞15分钟，用自来水缓缓洗去死细胞和固定液。

2、每孔加0.1ml0.05%美蓝染液，染色20分钟，用自来水缓缓冲净染液，晾干。

3、每孔加0.2ml0.33mol/L盐酸溶解美蓝，振荡混匀。

在665nm波长处测定光吸收度。

计算TNF的活性。

4）中性红染色检测法：
1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μL细胞培养液的检测孔中，每孔加50μl5%中性红染液。

中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载体，致力于搭建产研结合的桥梁。

以“专心、专业、专注“为宗旨，致力于实现研究和应用的对接，从而推动化工行业的发展。

继续培养2小时。

2、小心倒去培养液。

用200μl Hanks液洗涤细胞1次。

小心倒去培养液，减少细胞丢失。

3、每孔加100μl脱色液，在摇床中轻轻摇晃溶解30分钟。

在550nm波长处测定OD值。

十、直接计数细胞：
1、如果靶细胞是帖壁细胞，在细胞因子作用适当时间后，用生理盐水洗去死亡细胞，用0.25%胰蛋白酶液消化细胞。

加适量生理盐水吹打，使细胞分散成单个细胞。

直接在血细胞计数板上计数细胞。

2、如果靶细胞是悬浮细胞，则需要用染色剂区分死细胞和活细胞然后再计数。

通常用台盼蓝染色细胞，活细胞可以排除进入细胞的台盼蓝而不着染，死细胞着染呈深蓝色。

3、计数血细胞计数板上4个大方格中的全部活细胞，按下式计算活细胞数：活细胞数（个/ml）＝计数的全部活细胞数×10000×2×1/4。

中心以化工行业技术需求和科技进步为导向，以资源整合、技术共享为基础，分析测试、技术咨询为载体，致力于搭建产研结合的桥梁。

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