实验七 植物原生质体的分离和培养

实验七植物原生质体的分离和培养
一、实验目的：
了解植物原生质体分离的基本原理及其过程
二、实验原理：
植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。

是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。

植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。

1954年，植物单细胞培养才获得成功。

Mllir 培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；1960年Jones等建立了微室培养法。

同年，Cocking应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。

随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是基于植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，获得原生质体。

其原理是根据由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。

原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组成，以及原生质体收集方法有关。

酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。

渗透剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。

酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。

游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯化，然后进行培养。

三、实验用品
1、器材：
三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤器、培养瓶、台式离心机、高压灭菌锅。

2、实验材料：菠菜叶片
3、试剂：
（1）、酶解液成分如下：
纤维素酶(cellulase，Onozuka )2%；
果胶酶(13ectinase，Serva) 1 % (若用国产EA3-867纤维索酶，则果胶酶可省去。

) ；
甘露醇0.6 mol／L ；
CaCl2 0.05 mol／L ；
MES 0.1％；调整 pH 5.8-6.2
（2）、0.2 mol／L 的CaCl2
四、实验方法
取菠菜幼嫩的叶片，洗净晾干切成细丝
↓
置于酶解液中，在摇床上（60～70rpm），在25～28℃黑暗条件下，酶解5～7h。

↓
用200目滤网过滤除去未完全消化的残渣。

此时可直接取过滤液进行显微镜下观察。

↓
留下一小部分过滤液作为对照，其余的液体在600-1000rpm条件下离心3-5分钟，弃上清。

（此步转速过高有可能导致原生质体破裂）
↓
用移液管吸去上清液。

将沉淀的原生质体用1ml 0.2 mol／L的CaCl2溶液重悬。

镜下观察。

↓
可加一滴0.1％酚藏花红溶液后，观察原生质体的生活率如何。

五、作业：
记录原生质体的分离过程，显微镜下进行观察及绘图，并分析原生质体制备的效果如何。

注意：
凡是活力的原生质体均呈现圆球型，（一般可以在显微镜下可观察到胞质环流运动，但在叶肉细胞制备的原生质体中由于叶绿体的阻挡，往往看不清胞质环流。

）在观察完原生质体的大体制备效果之后，可再取一滴原生质体悬液放在载波片上，加一滴0.1％酚藏花红溶液。

注意凡生活的原生质体均不着色，而死去的原生质体立即着染成红色。

可据此分析原生质体分离制备的效果如何。

下图为制备并纯化后的高浓度原生质体形态参考图。

我们的实验效果一般无法达到这样的浓度。

（由于实验中所用材料主要是叶肉细胞，因此大部分原生质体均富含叶绿体。

只有个别原生质体可能是表
皮细胞或保卫细胞形成，因此是无色的看不到叶绿体。

原生质体的大小差异是源于植物体细胞的大小不同。

一般生活着的原生质体均是圆形的，凡是发扁或者不规则的，往往是死亡的，可以通过0.1％酚藏花红染色来进一步确定。

）。