蛋白质工程

蛋白质工程

食品08春博李煜林学号：B080103C06

一. 蛋白质工程的概念

蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。

蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：(1)根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；(2)确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质。

蛋白质工程主要包括蛋白质结构分析、蛋白质的创造和改造等步骤。

二. 蛋白质结构分析

蛋白质工程的核心内容之一就是收集大量的蛋白质分子结构的信息，以便建立结构与功能之间关系的数据库，为蛋白质结构与功能之间关系的理论研究奠定基础。

1. 蛋白质的分子结构

蛋白质分子的结构有4个严格的层次，即蛋白质的一级至四级结

构。

2. 蛋白质结构测定

(1). 一级结构测定

蛋白质一级结构的测定又称蛋白质顺序分析，其基本方法是：(1)应用化学裂解法和蛋白酶水解法将多肽链专一性裂解；(2)逐一测定每个纯化的小肽段的顺序；(3)根据肽段氨基酸顺序中的重叠区确定小肽段的排列次序；(4)完成整条多肽链的顺序分析。

尽管蛋白质顺序分析已经自动化，但仍然耗时、复杂并且昂贵。重组DNA技术出现后，人们可以从cDNA或基因序列直接推导出蛋白质的氨基酸顺序，速度快且经济，已成为最常用的测定蛋白质一级结构的方法。

(2). 蛋白质三维结构测定

根据蛋白质的状态，测定蛋白质三维结构的方法分为两大类：(1)应用X射线晶体衍射图谱法(X-ray crystallography)和中子衍射法测定晶体中的蛋白质分子构象；(2)应用核磁共振法(nuclear magnetic resonance，NMR)、园二色性光谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外差光谱法和氢同位素交换法等测定溶液中的蛋白质构象。

利用X射线晶体衍射法测定蛋白质分子的构象，结果比较可靠。但是，与溶液中的构象相比，蛋白质分子在晶体中的构象是静态的。所以，利用蛋白质晶体不能测定不稳定的过渡态的构象。而且，很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶。另外，X射线晶体衍射的工作流程较长。

图1 X射线晶体衍射的基本原理

核磁共振是指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频（radio frequency, RF）辐射的物理过程。

近年来，NMR法测定小蛋白的三维结构得到了成功的应用。NMR 法不需要制备蛋白质晶体，但这种方法仅限于分析长度不超过150个氨基酸残基的小蛋白。

图2 NMR测定蛋白质三维结构的基本过程

其它方法可以测定溶液中蛋白质分子的局部构象，但很难获得蛋白

质分子完整的三维结构，在应用上存在较大的局限性。

根据天然蛋白质结构与功能分析建立起来的数据库里，可以预测一定氨基酸序列肽链空间结构和生物功能；反之也可以根据特定的生物功能，设计蛋白质的氨基酸序列和空间结构。通过基因重组等实验可以直接考察分析结构与功能之间的关系；也可以通过分子动力学、分子热力学等，根据能量最低、同一位置不能同时存在两个原子等基本原则分析计算蛋白质分子的立体结构和生物功能。虽然这方面的工作尚在起步阶段，但可预见将来能建立一套完整的理论来解释结构与功能之间的关系，用以设计、预测蛋白质的结构和功能。

三. 蛋白质的创造和改造

蛋白质的分子设计是蛋白质工程的一个重要方面。设计分成三类：一是小范围改造，就是对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换，来研究和改善蛋白质的性质和功能；二是较大程度的改造，是对来源于不同蛋白质的结构域进行拼接组装，期望转移相应的功能；三是蛋白质从头设计，所谓蛋白质从头设计就是给定一个目标三维结构，要求找出与已知顺序无明显同源，能折叠成目标结构的氨基酸顺序来。蛋白质从头设计与蛋白质结构预测恰恰相反，后者是从顺序出发，预测其所折叠成的三维结构。

1. 定点突变

蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码决定的，只要改变其中的一个或两个就可以改变氨基酸。通常是改变某个位置的氨基酸，以研究蛋白质的结构、稳定性或催化特性。例如将t－PA Asn117替换为Glu117，从而除去一个原有的糖基化位点。由于该处原有的糖链能促进t－PA从血浆清除，因此定点突变后能够降低t－PA的血浆清除率，延长血浆半衰期。

2. 盒式突变

1985年Wells提出的一种基因修饰技术——盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨

基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧添加两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因。

3. 蛋白质融合

将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。这种方法可以将不同蛋白质的特性集中在一种蛋白质上，显著地改变蛋白质的特性。现在研究的较多的所谓“嵌合抗体”和“人源化抗体”等，就是采用的这种方法。

4. 蛋白质的从头设计

成功地从头设计一个蛋白质或活性位点需要正确理解所有有关的相互作用，理论的正确与否与设计成功与否直接相关。由于设计的蛋白质是由一个算法(algorithm)采用一组描述相互作用的参数而产生，因此在设计参数和蛋白质特性之间可以建立直接的实验联系。

(1). 设计策略

设计的一般策略是“设计循环”(design cycle)，就是理论设计和实验验证交互进行，逐步发展。首先由一个算法，基于某些理论和研究结果，设计出初始分子模型；然后实际构建这个分子，用各种手段分析它，寻找成功或失败或不理想的原因，接着修改算法、参数、理论基础、改进模型，进行重新设计，如此循环反复。在这个过程中，复杂程度渐进提高，对蛋白质结构和功能的理解也逐渐深刻丰富起来。(2). 考虑因素

具体设计中要考虑的因素较多，例如要正确选择二级结构倾向性的残基，正确布置适应目标结构的“二元模式” (Binary pattern)，正确选择转角、帽结构以连接和终止螺旋，正确选择适应于堆积核心的疏水侧链，另外还可以导入内部的极性作用。主要有二元模式、二级结构倾向性、互补堆积(complementary packing)等。