荧光免疫层析技术原理进展ppt课件

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• 固定相是固体物质或固定于固体物质上的 成分。
• 流动相是可以流动的物质,如水或各种溶 剂。
• 层析过程:当待分离混合物随流动相通过 固定相时,由于混合物各组分的理化性质 的差异,与固定相相互作用弱的组分随流 动相移动时受到的阻滞作用小,向前移的 速度快;与固定相相互作用强的组分向前 移动的速度慢。从而实现混合物中各组分 的分离。
• 游离物在C线处发生免疫反应。

层析方向
免疫反应


T
C
免疫层析技术基本原理示意图
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常用荧光免疫层析法
夹心法
竞争法
•双抗原夹心法 双抗体夹心法
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竞争法
待测物中的某种抗原与T(检测线)线处同 种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过程。
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Hale Waihona Puke Baidu
竞争法
结合垫
含抗原 A
免疫层析法检测的实物 图
Y1:A的单抗与标记物的偶联体 Y2:抗原A Y3:羊抗鼠二抗
荧光免疫层析技术的原理与进展
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荧光免疫层析技术的基本原理
层析法(chromatography)的原理是利用混 合物中各组分的物理性质之差(如吸附力、 分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、 分配系数等)而建立来的一种分离技术。 层析系统是由固定相(stationary phase) 和流动(Mobile Phase)相组成。
• ③使用简便,安全无毒,可适用于定量分析与多 重分析,在一般的实验室或野外现场都可轻松应 用.
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UCP应用举例
• 中科院报道了一种用 于免疫活性检测的UCP 试纸条读数计,采用 半导体激光器作为光 源,CCD作为光电接收 器,步进电机带动控 制试纸条移动的装置
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其他 碳纳米管
胶体金 标记物
量子点 镧系元素
纳米磁性材料
有机纳米粒子
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胶体金
• 金颗粒之间存在的静电斥力使其在水中保持相 对稳定的状态,形成稳定的水溶性胶体,即称 为胶体金
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• 胶体金既有明亮的色彩, 又有高电子密度,可以吸 附生物大分子,且不影响 生物分子的活性,故可作 为生物分子的标志物,用 于免疫反应中抗原或抗体 的标记定位,定性甚至定 量研究。层析试纸标记用 金颗粒的直径大多在 20~ 40 nm,呈深红色。

层析方向
免疫反应


T
C
免疫层析技术基本原理示意图
5
荧光(fluorescence)
• 荧光物质吸收激发光的能量后,电子从基态跃
迁到激发态,当其回复至基态时,以发射光形式 释放出能量,称为荧光。
发射光谱和激发光谱
发射光谱是指固定激发波长,在不同波长下
记录的样品发射荧光的强度。
激发光谱是指固定检测发射波长,用不同波
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• 两种不同镧系元素离子( 分别作为光 吸收子和发射子) 掺杂入亚微米尺寸 的陶瓷颗粒( 作为主基质) 中,会构 成一类能上转发光产生荧光的特殊材 料。—— UCP( up-converting phosphor,UCP) 颗粒。
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• UCP 颗粒主要含有如 A3 下三种成分:
• 主基质:氧硫化物
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夹心法
• 待测物中某种抗体(抗原)与T线处抗原A (抗原A)以及荧光标记的抗原(抗体)特 异性相结合的过程,在T线处形成抗体A+抗 原+抗体B形式的夹心结构。
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
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双抗体夹心法
待测液含抗原Ag
(k)Ab1-Ag
(k)Ab1-Ag-Ab2
Ab3-(k)Ab1
(k)Ab1
3
免疫层析法
• 免疫层析技术是建立在层析技术和抗 原一抗体特异性免疫反应基础上的一 项新兴免疫检测技术。
4
• 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤 维层析材料为固定相,测试液为流动相,通过毛 细作用使待测物在层析条上移动。
• 待测物在T线处发生特异性免疫反应。
• 游离物在C线处发生免疫反应。
长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射
强度。
6
荧光效率
定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率
计算公式:
发射荧光的光量子数( 荧光强度)
荧光效率= 吸收光的光量子数(激 发光强度)
荧光寿命
定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程 度时所用的时间。 各种荧光物质的荧光寿命不同。
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荧光淬灭
(Y2O2S,GdO2S)、氟
化物(YF3,GdF3)、硅 S2
A2
酸盐
(YSi2O5,YSi3O7)...
• 吸收子Yb3+ Er3+ Sm3+ S1
A1
• 发射子Er3+ Ho3+ Tm3+
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UCP独特的优势
• ①高敏感性,有报道 UCP 的灵敏度可达胶体金的 100 倍。
• ②高稳定性,UCP 的发光信号不受检测环境或样 品腐蚀或标志物自身衰变等的影响,可长期存放 和可重复。
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• 胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗 粒表面的过程。
• 由于蛋白分子牢固地结合在金颗粒表面,形成一 个蛋白层,阻止了胶体金颗粒的相互接触,而使 胶体金处于稳定状态。
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• 胶体金作为标志物有以下优势: • ①几乎可标记所有的蛋白分子,过程简单,
效率高,用量少,便宜,基本不改变被标 记蛋白的活性。且稳定,无毒,使用方便, 保质期长。 • ②不同直径的纳米金可以用于多重标记。 • ③结果判断只需普通光学仪器或直接肉眼 观察。
阳性结果T,C均有颜
Ab2

T
C
待测液,不含抗原Ag
(k)Ab1
(k)Ab1
Ab3-(k)Ab1
(k)Ab1
T
双抗体加心法检测原理图
阴性结果T无颜色,C
Ab2
有颜色
C
K代表某一标记物
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
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双抗原夹心法
双抗原夹心反应模式阳性检测(左)与阴性检测(右)
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• 利用荧光免疫层析试纸条可以实现对待测 物的定性或者定量检测.
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胶体金作为标记物的应用
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试孕纸
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应用(定量)
• 08天津大学精密仪器 与光电子工程学院与 天津市进出口检验检 疫局合作开发研发一 种便携式仪器。
• 竞争法原理 • 用于农药残留定量检

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2 镧系元素 • 镧系元素又称为稀土金属元素,指元素周
期表中原子序数 57~71 的所有元素。
• 定义:荧光物质在某些理化因素作用下,发 射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。
• 引起荧光淬灭的因素:有如紫外线照射、 高温、某些硝基化合物、重氮化合物等。
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• 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤 维层析材料为固定相,测试液为流动相,通过毛 细作用使待测物在层析条上移动。
• 待测物在T线处发生特异性免疫反应。
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