毛细管电泳中常用的检测方法.

毛细管电泳中常用的检测方法

毛细管电泳(C E 以其高效、快速的分离, 成为一种令人瞩目的分析手段。为了便于热量散失和进行柱上检$lJ , 采用了极小内径的毛细管(≤50 umi.d. , 这样允许进样量就很小(10 一9 g 。如此小的进样量要求有高灵敏的检测方法, 才能进行定性、定量分析。

紫外吸收法:

一般, 常用于C E 的检测器是市售的紫外和荧光检测器。当采用紫外一可见吸收法时, 石英毛细管壁的内涂层常常用有机溶剂溶解或灼烧而刮去, 使出现一个“小窗口” , 作为柱上检测的流通池。内径很小的毛细管使得流通池的长度也相应很小, 检测灵敏度相当有限, 尤其在生物样品分析中常常需要先行样品预富集然后再检测, 以提高灵敏度。在使用长方形徽面的毛细管进行电泳分离分析时,柱上检测的光学流通池长度明显增大, 使检测灵敏度提高7 1 5 倍。采用高能量的光源, 如氨灯、激光等, 可较大地提高检测灵敏度, 但费用较高, 又因可供选择使用的人射光波长范围较窄, 限制了它的应用。

荧光检测法:

荧光检测的灵敏度比紫外吸收法高几个数量级。对于有适当的激发荧光和发射荧光的供试品, 采用激光诱导荧光检测法和光电倍增管, 可使检测灵敏度大大提高, 而对于绝大多数无自然荧光的化合物, 则必须进行柱前或柱后衍生化, 才能进行荧光检测。

间接检测法:

对供试品进行衍生化的操作繁琐, 且易引入误差, 对于被测浓度极低的生物样品更是如此。于是, 间接检测法应运而生。间接检测就是在电泳缓冲液中加入具有检测响应的检测剂, 如发色团、荧光物质等, 作为本底响应,以产生基线信号。供试品进样后, 供试品离子与反电荷的检测剂离子形成离子对, 或置换了检测剂的同电荷离子, 分别产生正峰和负峰,使基线信号发生改变而被检测。在间接荧光法中, 被分析

物能吸收荧光辐射或使本底荧光淬灭, 本底信号因此降低或消失而进行检测。这种方法要求供试品必须能吸收荧光或淬灭荧光。

在间接检测法中, 即或存在着相对大量的本底检测剂, 痕量的供试物也能与之从容地充分反应, 产生检测信号, 从而获得较为理想的灵敏度。应该指出的是, 毛细管直径、光源、检测剂的固有性质等, 都将对间接检测结果产生影响

电化学检测法:

电化学检测器的灵敏度高、选择性好, 但由于超微电极的制做和柱后检测单元的设计较困难, 使其应用受到了限制。W al lin g fo rd 等巧妙地设计了一个毛细管区带电泳(c a p illar yZ o n e ele c tr o ph o r e sis , C z E 的在线电化学检测系统, 把C Z E 的高效分离和电化学检测的高灵敏度结合起来, 实现了在单个神经细胞水平上的测定。

化学发光法:

C as p e rs o n 用化学发光法检测电泳凝胶中的

D N A 段, 检测量可低至1.1 x 10-12 g。以结合了辣根过氧化酶的亲合素对生物素化的D N A 进行亲合性标记, 当此D N A 通过浸泡在过氧化氢和苯巴比妥混合溶液中的电泳凝胶时, 辣根过氧化酶催化过氧化氢还原成水, 释放出的能量转移给化学发光剂苯巴比妥, 激发态的苯巴比妥返回基态时发射出的光信号可被照相底片所记录, 进行检测。化学发光法具有灵敏度高、线性范围宽、反应速度快、选择性好等特点, 因检测器不

需光源和单色器,消除了光源不稳定和杂散光的影响, 因此灵敏度比荧光检测法还要高。

由于采用了内径极小的毛细管, 相应地也给化合物定性鉴别带来了困难, 要使极小的样品量足够于进行定性鉴定, 可以用高灵敏的光二极管阵列检测器获得供试品的吸收光谱。

C E 与M S 联用法:

将C E 与高灵敏度、高专属性的M S 联用是一种强有力的分离检测手段。目前主要有两种接口: 电喷雾离子化( electrosprayionizatio n , ESI 接口和同轴连续流动(coaxial continuous 一flow , CCE 接口, 已应用于小分子或大分子复杂供试品的分离分析。Reinhoud 运用静止和扫描的阵列检测的M S 法, 检测了β一内啡呔的碎片, 最低检测限可达2 一5fmol。Moseley 采用同轴连续流动快原子轰击接口, 以CZE 一MS 联用, 获得了样品单分子离子的质谱图。六种肽的碎片的检测限可达14 一1 5 0 fm o l。有人报道C E 与快原子轰击质谱联用时, 阵列质量检测系统与常规的电子放大器检测系统相比,可使灵敏度提高10 一10 0 倍, 如将C E 与M S一M S 串联使用, 则可获得更为准确和详尽的供试品质量和结构信息。

综上所述, 许多检测方法均可用于C E,由于C E 检测要求极高的灵敏度, 灵敏度较高的检测法, 如激光诱导荧光检测法、电化学检测法、化学发光法、M S 法等有较大的发展前景。同时, 有些检测法的应用较为成熟, 如紫外吸收法等, 应扬长补短, 充分发挥各自的作川。此外, 应重视操作简单、灵敏度好的间接检测法。