产蛋白酶乳酸菌的筛选及蛋白酶的纯化
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将 ２１ 种乳酸菌分离纯培养并增殖后， 划线培 养于酪蛋白琼脂平板培养基， 选择菌落周围形成 透明圈的菌种， 初步筛选出产蛋白酶的乳酸菌［８］。
将 ２１ 种乳酸菌在 ＭＲＳ 培养基中进行增殖培 养（ ３７ ℃） ， 当每种菌株生长达到稳定期的时候， 离心培养液， 取上清进行蛋白酶活力的测定（ 采用 国标 ＳＢ／Ｔ１０３１７－ １９９９ 蛋白酶活力测定法进行 蛋 白酶活力的测定） ， 每种乳酸菌进行 ３ 次平行实 验。比较福林试剂作用显色后在 ６６０ ｎｍ 处的 ＯＤ 值（ 因 ＯＤ 值就能反映各菌种蛋白酶的活性强弱， 故并没有将 ＯＤ 值换算成酶活力） ， 进一步确定蛋 白酶活性强的乳酸菌种。 １．２．２ 蛋白酶的分离纯化
酪蛋白水解作用结果见图 ５。
图 １ ＡＳ１．１９３６ 菌种酪蛋白琼脂培养形成的透明圈 表 １ 各种乳酸菌蛋白酶活力测定 ＯＤ 值的比较
菌种 ＯＤ 值 菌种 ＯＤ 值 菌种 ＯＤ 值 １ 号 １．３１７ ８ 号 １．２３６ １５ 号 １．３５１ ２ 号 １．３０７ ９ 号 １．２９７ １６ 号 １．３３２ ３ 号 １．３４９ １０ 号 １．４０１ １７ 号 １．３３７ ４ 号 １．３２７ １１ 号 １．３３１ １８ 号 １．３７５ ５ 号 １．４４０ １２ 号 １．３２３ １９ 号 １．３２９ ６ 号 １．３３７ １３ 号 １．２５６ ２０ 号 １．３３７ ７ 号 １．３２５ １４ 号 １．３０９ ２１ 号 １．３５４
中图分类号： ＴＳ２５２．１ 文献标识码： Ａ 文章编号： １６７１－ ５１８７（２００８）０４－ ０１６０－ ０３
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｐｒ ｏｄｕｃｅｄ Ｐｒ ｏｔｅｉｎａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｕｒ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒ ｏｔｅｉｎａｓｅ
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《乳业科学与技术》 ２００８ 年第 ４ 期 （ 总第 １３１ 期）
图 ７ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ－ ５５Ｆ 柱层析所得 ２ 个峰 对酪蛋白的水解作用结果
③Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 凝胶过滤层析（ 流速为 ２．０ ｍＬ／ｍｉｎ） 所得图谱见图 ８， 所得各峰对酪蛋白水解 作用结果见图 ９。
１ 材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 本实验室现有的 ２１ 种乳酸菌［５－７］， 分别标记 为 １－ ２１ 号。 １．１．２ 主要试剂： 酪蛋白， ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ－ ５５Ｆ
收稿日期： ２００８－ ０４－ １０； 作者简介： 陈超， 女， 硕士研究生， 主要从事乳酸菌的研究； 通讯 作者： 高学军， 男， 博士生导师； 基金项目： 黑龙江重大科技攻关项目（ ＧＡ０７Ｂ４０１－ ５） 。
Ｃｈｅｎ Ｃｈａｏ， Ｇａｏ Ｘｕｅｊｕｎ， Ｌｉｕ Ｙｉｎｇ， Ｙｕａｎ Ｘｉａｏｈａｎ
（ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ ｏｆ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ １５００３０， Ｐ． Ｒ． Ｃｈｉｎａ）
由图 １０ 可以看出， ５ 号乳酸菌所产生蛋白酶 的分子质量在 ３５ ＫＤ 左右， 经过 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 凝胶过滤层析达到了电泳纯的程度， Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 凝胶过滤层析可以将其分离纯化。
图 １０ 蛋白酶纯化后 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 分析结果
参考文献
［１］ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＪＥ， Ｄｕｄｌｅｙ ＥＧ， Ｐｅｄｅｒｓｏｎ ＪＡ．Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ［Ｊ］． Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ， １９９９， ７６：２１７－ ２１８．
２ 结果与分析
２．１ 产蛋白酶乳酸菌种的筛选 观察各菌种的酪蛋白琼脂平板培养基， 发现
ＡＳ１．１９３６ 乳 酸 乳 球 菌 乳 酸 亚 种 菌 落 周 围 的 透 明 圈最大（ 如图 １） 。福林试剂作用显色后在 ６６０ ｎｍ 处的光吸收 ＯＤ 值见表 １。
Ｌａｎｅ１： 低分子质量蛋白质 Ｍａｒｋ
Ｌａｎｅ２： 空培养基
粗酶液的制备： 将筛选得到的乳酸菌种用普
陈 超等： 产蛋白酶乳酸菌的筛选及蛋白酶的纯化
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通的 ＭＲＳ 液体培养基进行增殖培养， 在出现混浊 现象后期的时候， 将培养液 ５０００×ｇ 离心 １０ ｍｉｎ， 所得上清即得粗酶液。ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ： 将所得酶液进 行 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ （ ５％ 浓 缩 胶 ， ８％ 分 离 胶 ， ６％ 分 离 胶） ， 通过电泳结果观察粗酶液中所含蛋白的情 况。柱层析凝胶填料的筛选： 根据 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 所 得的实验结果进行柱层析填料的筛选。用直径 ２．７ ｍｍ 的打孔器在酪蛋白琼脂平板培养基上打 孔， 将 １５０ μＬ 所得各峰 ５ 倍浓缩液加到所打的孔 中， ３７ ℃恒温培养 ４８ ｈ， 观察孔周围透明圈的情况， 以确定蛋白酶所在峰的位置。将蛋白酶所在峰的浓 缩液进行ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ， 以确定蛋白酶液的纯度。
Ｌａｎｅ１： 次高分子质量蛋白质 Ｍａｒｋ
Ｌａｎｅ３、４： 粗酶液
Ｌａｎｅ２、３： 粗酶液
图 ２ 粗酶液 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 图 ３ 粗酶液 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ
（ ８％） 分析结果
（ ６％） 分析结果
２．２．２ 柱层析凝胶填料的筛选
根据 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 电泳所得到的结果， 本实验
选 择 ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ － ５５Ｆ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ － ７５、
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《乳业科学与技术》 ２００８ 年第 ４ 期 （ 总第 １３１ 期）
产蛋白酶乳酸菌的筛选及蛋白酶的纯化
陈 超， 高学军， 刘 营， 袁肖寒 （ 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室， 黑龙江哈尔滨 １５００３０）
摘 要： 乳酸菌已广泛的应用到酸奶和微生态制剂中。为获得具有产蛋白酶优良性能的乳酸菌种， 对实 验室保存的 ２１ 种乳酸菌种进行产蛋白酶能力筛选， 并对蛋白酶进行分离纯化。从而获得一种产蛋白酶 的乳酸菌种， 并将所产蛋白酶成功纯化， 得到其分子质量在 ３５ ＫＤ 左右。 关键词： 乳酸菌； 蛋白酶； 筛选； 纯化
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ２００ 从中筛选柱层析凝胶填料。
缓冲液： ０．０２ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．０ 磷酸盐缓冲液＋
０．３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌwk.baidu.com３‰ ＥＤＴＡ
所用玻璃柱的规格为： "１．６ ｃｍ×３０ ｃｍ
① 葡 聚 糖 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ２００ 凝 胶 过 滤 层 析
（ 流 速 ０．２ ｍＬ／ｍｉｎ） 所 得 图 谱 见 图 ４， 所 得 各 峰 对
本实验筛选得到产蛋白酶的乳酸菌种； 通过 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 分子筛柱层析纯化培养液中乳酸 菌所产的胞外蛋白酶， 并达到电泳纯。另外 ２ 种柱 层析填料不能有效将目的蛋白和其它蛋白分开 ３．３ 产蛋白酶乳酸菌种应用前景
本实验筛选出产蛋白酶的乳酸菌株， 为酸奶 及微生态制剂的制造提供了优良菌株。提纯了所 产的蛋白酶， 其性质和应用尚待进一步的研究。
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ （ ＬＡＢ） ａｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｓｕｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｏｇｕｒｔ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ． ＬＡＢ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｈａｖｅ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ２１ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ＬＡＢ ｓｔｒａｉｎｓ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｏｕｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｇｅｔ ｆｉｎｅ ＬＡＢ ｓｔｒａｉｎ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ． Ｓｏ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ＬＡＢ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｐｒｏｄｕｃｅ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｅｉｇｈｔ ｉｓ ａｂｏｕｔ ３５ ＫＤ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ； ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
图 ４ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ２００ 过柱图谱
图 ５ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ２００ 柱层析所得 ３ 个峰对酪蛋白的水解作用结果
②ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ－ ５５Ｆ 凝胶过 滤 层 析（ 流 速为 １．５ ｍＬ／ｍｉｎ） 所得图谱见图 ６， 所得各峰对酪 蛋白水解作用结果见图 ７。
图 ６ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ－ ５５Ｆ 过柱结果
因 为 乳 酸 菌 所 用 的 ＭＲＳ 培 养 基 的 颜 色 对 ６８０ ｎｍ 的光吸收有很大的影响， 不能精确的反映 出每种菌产蛋白酶的能力。故采取乳酸菌划线培 养于酪蛋白琼脂平板培养基观察透明圈生成的方 法， 结合比较蛋白酶活力高低的方法， 综合筛选产 出蛋白酶的乳酸菌种。 ３．２ 蛋白酶分离纯化柱层析填料的选择
（ ＴＯＳＯＨ 公司） ， 葡聚糖 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 和葡聚糖 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ２００（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ 公司） ， １４４００ＭＷ 透析袋 １．１．３ 主要仪器： 台式离心机（ 上海安亭科学仪器 厂） ， 稳压稳流电泳仪（ 北京六一仪器厂） ， 电热恒 温培养箱 （ 上海博迅实业有限公司医疗设备厂） ， 电泳槽（ 北京市六一仪器厂） 。 １．２ 方法 １．２．１ 产蛋白酶菌种的筛选
乳 酸 菌（ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ， ＬＡＢ） 是 一 大 类 能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳 酸的细菌， 目前已知有 ２００ 多种 ＬＡＢ［１］。相当多的 ＬＡＢ 是 益 生 菌 ， 其 作 为 益 生 菌 有 如 下 依 据 ： 其 属 于肠道正常菌群， 对人和动物的健康是有益的［２］。 在 农 业 、兽 医 、医 学 以 及 食 品 工 业［３－４］中 是 很 重 要 的。目前关于乳酸菌应用到乳制品中制成酸奶的 报道很多， 但是对于乳酸菌代谢产物的报道却很 少， 特别对产蛋白酶的乳酸菌尚没有报道。本实验 以实验室保存的 ２１ 种乳酸菌为基础， 对产蛋白酶 的乳酸菌种进行了筛选， 并将所产的蛋白酶进行 了分离纯化， 以期为酸奶的生产研制和微生态制 剂的研发提供更优良的菌种。
图 ９ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 柱层析所得 ４ 个峰对酪蛋白的水解作用结果
由图 ５ 和图 ７ 可以看出， 各峰所在的空周围 并不能明显看到透明圈， 不能确定蛋白酶所在峰 的 位 置 ， 说 明 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ２００ 和 ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ－ ５５Ｆ 并不能将培养液中的蛋白完全分开， 也 得不到相对较纯的蛋白酶。由图 ９ 可以看出， 第 ４ 峰所在的孔周围形成了透明圈， 确定为蛋白酶存 在的位置， 用福林试剂检测法测定第 ４ 峰 ５ 倍浓 缩 液 的 活 性 为 ６．８６ Ｕ／ｍＬ 用 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 检 测 蛋 白酶的纯度和分子质量（ 如图 １０） 。
由表 １ 可知， ５ 号菌种所产的蛋白酶活力最 强， 与酪蛋白平板培养基观察的结果一致。 ２．２ 蛋白酶的分离纯化 ２．２．１ ５ 号菌种粗酶液的 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ （ 分离胶 ８％ 和 ６％） 分析图谱见图 ２ 和图 ３。
由图 ２ 和图 ３ 可以看出， ＭＲＳ 空培养基所在 的泳道没有蛋白存在， 因培养基中的胨分子量太 小， 故 ８％分离胶的 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 没有条带， ５ 号菌 培养基的上清液中有两种蛋白， 一种蛋白的分子 质量在 ３５ ＫＤ 左右， 另一种蛋白的分子质量 在 １５０ ＫＤ 左右。
图 ８ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 过柱结果
３ 讨论
３．１ 产蛋白酶乳酸菌种的筛选方法 在培养过程中， 笔者发现酪蛋白琼脂平板培
养基在培养乳酸菌之前都是透明的， 当培养乳酸 菌一段时间后， 培养基变为乳白色， 这说明乳酸菌 所产生的乳酸将培养基中的酪蛋白变性， 导致培 养乳酸菌后平板培养基呈现乳白色。若某乳酸菌 产生蛋白酶， 则蛋白酶会将此乳酸菌周围的酪蛋 白水解， 导致其周围有透明圈的出现， 从而初步筛 选出产蛋白酶的乳酸菌种。
将 ２１ 种乳酸菌在 ＭＲＳ 培养基中进行增殖培 养（ ３７ ℃） ， 当每种菌株生长达到稳定期的时候， 离心培养液， 取上清进行蛋白酶活力的测定（ 采用 国标 ＳＢ／Ｔ１０３１７－ １９９９ 蛋白酶活力测定法进行 蛋 白酶活力的测定） ， 每种乳酸菌进行 ３ 次平行实 验。比较福林试剂作用显色后在 ６６０ ｎｍ 处的 ＯＤ 值（ 因 ＯＤ 值就能反映各菌种蛋白酶的活性强弱， 故并没有将 ＯＤ 值换算成酶活力） ， 进一步确定蛋 白酶活性强的乳酸菌种。 １．２．２ 蛋白酶的分离纯化
酪蛋白水解作用结果见图 ５。
图 １ ＡＳ１．１９３６ 菌种酪蛋白琼脂培养形成的透明圈 表 １ 各种乳酸菌蛋白酶活力测定 ＯＤ 值的比较
菌种 ＯＤ 值 菌种 ＯＤ 值 菌种 ＯＤ 值 １ 号 １．３１７ ８ 号 １．２３６ １５ 号 １．３５１ ２ 号 １．３０７ ９ 号 １．２９７ １６ 号 １．３３２ ３ 号 １．３４９ １０ 号 １．４０１ １７ 号 １．３３７ ４ 号 １．３２７ １１ 号 １．３３１ １８ 号 １．３７５ ５ 号 １．４４０ １２ 号 １．３２３ １９ 号 １．３２９ ６ 号 １．３３７ １３ 号 １．２５６ ２０ 号 １．３３７ ７ 号 １．３２５ １４ 号 １．３０９ ２１ 号 １．３５４
中图分类号： ＴＳ２５２．１ 文献标识码： Ａ 文章编号： １６７１－ ５１８７（２００８）０４－ ０１６０－ ０３
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｐｒ ｏｄｕｃｅｄ Ｐｒ ｏｔｅｉｎａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｕｒ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒ ｏｔｅｉｎａｓｅ
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《乳业科学与技术》 ２００８ 年第 ４ 期 （ 总第 １３１ 期）
图 ７ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ－ ５５Ｆ 柱层析所得 ２ 个峰 对酪蛋白的水解作用结果
③Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 凝胶过滤层析（ 流速为 ２．０ ｍＬ／ｍｉｎ） 所得图谱见图 ８， 所得各峰对酪蛋白水解 作用结果见图 ９。
１ 材料与方法
１．１ 材料 １．１．１ 本实验室现有的 ２１ 种乳酸菌［５－７］， 分别标记 为 １－ ２１ 号。 １．１．２ 主要试剂： 酪蛋白， ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ－ ５５Ｆ
收稿日期： ２００８－ ０４－ １０； 作者简介： 陈超， 女， 硕士研究生， 主要从事乳酸菌的研究； 通讯 作者： 高学军， 男， 博士生导师； 基金项目： 黑龙江重大科技攻关项目（ ＧＡ０７Ｂ４０１－ ５） 。
Ｃｈｅｎ Ｃｈａｏ， Ｇａｏ Ｘｕｅｊｕｎ， Ｌｉｕ Ｙｉｎｇ， Ｙｕａｎ Ｘｉａｏｈａｎ
（ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ ｏｆ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ １５００３０， Ｐ． Ｒ． Ｃｈｉｎａ）
由图 １０ 可以看出， ５ 号乳酸菌所产生蛋白酶 的分子质量在 ３５ ＫＤ 左右， 经过 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 凝胶过滤层析达到了电泳纯的程度， Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 凝胶过滤层析可以将其分离纯化。
图 １０ 蛋白酶纯化后 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 分析结果
参考文献
［１］ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ＪＥ， Ｄｕｄｌｅｙ ＥＧ， Ｐｅｄｅｒｓｏｎ ＪＡ．Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ［Ｊ］． Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ， １９９９， ７６：２１７－ ２１８．
２ 结果与分析
２．１ 产蛋白酶乳酸菌种的筛选 观察各菌种的酪蛋白琼脂平板培养基， 发现
ＡＳ１．１９３６ 乳 酸 乳 球 菌 乳 酸 亚 种 菌 落 周 围 的 透 明 圈最大（ 如图 １） 。福林试剂作用显色后在 ６６０ ｎｍ 处的光吸收 ＯＤ 值见表 １。
Ｌａｎｅ１： 低分子质量蛋白质 Ｍａｒｋ
Ｌａｎｅ２： 空培养基
粗酶液的制备： 将筛选得到的乳酸菌种用普
陈 超等： 产蛋白酶乳酸菌的筛选及蛋白酶的纯化
１６１
通的 ＭＲＳ 液体培养基进行增殖培养， 在出现混浊 现象后期的时候， 将培养液 ５０００×ｇ 离心 １０ ｍｉｎ， 所得上清即得粗酶液。ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ： 将所得酶液进 行 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ （ ５％ 浓 缩 胶 ， ８％ 分 离 胶 ， ６％ 分 离 胶） ， 通过电泳结果观察粗酶液中所含蛋白的情 况。柱层析凝胶填料的筛选： 根据 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 所 得的实验结果进行柱层析填料的筛选。用直径 ２．７ ｍｍ 的打孔器在酪蛋白琼脂平板培养基上打 孔， 将 １５０ μＬ 所得各峰 ５ 倍浓缩液加到所打的孔 中， ３７ ℃恒温培养 ４８ ｈ， 观察孔周围透明圈的情况， 以确定蛋白酶所在峰的位置。将蛋白酶所在峰的浓 缩液进行ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ， 以确定蛋白酶液的纯度。
Ｌａｎｅ１： 次高分子质量蛋白质 Ｍａｒｋ
Ｌａｎｅ３、４： 粗酶液
Ｌａｎｅ２、３： 粗酶液
图 ２ 粗酶液 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 图 ３ 粗酶液 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ
（ ８％） 分析结果
（ ６％） 分析结果
２．２．２ 柱层析凝胶填料的筛选
根据 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 电泳所得到的结果， 本实验
选 择 ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ － ５５Ｆ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ － ７５、
１６０
《乳业科学与技术》 ２００８ 年第 ４ 期 （ 总第 １３１ 期）
产蛋白酶乳酸菌的筛选及蛋白酶的纯化
陈 超， 高学军， 刘 营， 袁肖寒 （ 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室， 黑龙江哈尔滨 １５００３０）
摘 要： 乳酸菌已广泛的应用到酸奶和微生态制剂中。为获得具有产蛋白酶优良性能的乳酸菌种， 对实 验室保存的 ２１ 种乳酸菌种进行产蛋白酶能力筛选， 并对蛋白酶进行分离纯化。从而获得一种产蛋白酶 的乳酸菌种， 并将所产蛋白酶成功纯化， 得到其分子质量在 ３５ ＫＤ 左右。 关键词： 乳酸菌； 蛋白酶； 筛选； 纯化
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ２００ 从中筛选柱层析凝胶填料。
缓冲液： ０．０２ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．０ 磷酸盐缓冲液＋
０．３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌwk.baidu.com３‰ ＥＤＴＡ
所用玻璃柱的规格为： "１．６ ｃｍ×３０ ｃｍ
① 葡 聚 糖 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ２００ 凝 胶 过 滤 层 析
（ 流 速 ０．２ ｍＬ／ｍｉｎ） 所 得 图 谱 见 图 ４， 所 得 各 峰 对
本实验筛选得到产蛋白酶的乳酸菌种； 通过 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 分子筛柱层析纯化培养液中乳酸 菌所产的胞外蛋白酶， 并达到电泳纯。另外 ２ 种柱 层析填料不能有效将目的蛋白和其它蛋白分开 ３．３ 产蛋白酶乳酸菌种应用前景
本实验筛选出产蛋白酶的乳酸菌株， 为酸奶 及微生态制剂的制造提供了优良菌株。提纯了所 产的蛋白酶， 其性质和应用尚待进一步的研究。
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ （ ＬＡＢ） ａｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｓｕｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｏｇｕｒｔ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔｓ． ＬＡＢ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｈａｖｅ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ２１ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ＬＡＢ ｓｔｒａｉｎｓ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｏｕｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｇｅｔ ｆｉｎｅ ＬＡＢ ｓｔｒａｉｎ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ． Ｓｏ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ＬＡＢ ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｐｒｏｄｕｃｅ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｅｉｇｈｔ ｉｓ ａｂｏｕｔ ３５ ＫＤ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ； ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
图 ４ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ２００ 过柱图谱
图 ５ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ２００ 柱层析所得 ３ 个峰对酪蛋白的水解作用结果
②ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ－ ５５Ｆ 凝胶过 滤 层 析（ 流 速为 １．５ ｍＬ／ｍｉｎ） 所得图谱见图 ６， 所得各峰对酪 蛋白水解作用结果见图 ７。
图 ６ ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ－ ５５Ｆ 过柱结果
因 为 乳 酸 菌 所 用 的 ＭＲＳ 培 养 基 的 颜 色 对 ６８０ ｎｍ 的光吸收有很大的影响， 不能精确的反映 出每种菌产蛋白酶的能力。故采取乳酸菌划线培 养于酪蛋白琼脂平板培养基观察透明圈生成的方 法， 结合比较蛋白酶活力高低的方法， 综合筛选产 出蛋白酶的乳酸菌种。 ３．２ 蛋白酶分离纯化柱层析填料的选择
（ ＴＯＳＯＨ 公司） ， 葡聚糖 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 和葡聚糖 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ２００（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ 公司） ， １４４００ＭＷ 透析袋 １．１．３ 主要仪器： 台式离心机（ 上海安亭科学仪器 厂） ， 稳压稳流电泳仪（ 北京六一仪器厂） ， 电热恒 温培养箱 （ 上海博迅实业有限公司医疗设备厂） ， 电泳槽（ 北京市六一仪器厂） 。 １．２ 方法 １．２．１ 产蛋白酶菌种的筛选
乳 酸 菌（ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ， ＬＡＢ） 是 一 大 类 能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳 酸的细菌， 目前已知有 ２００ 多种 ＬＡＢ［１］。相当多的 ＬＡＢ 是 益 生 菌 ， 其 作 为 益 生 菌 有 如 下 依 据 ： 其 属 于肠道正常菌群， 对人和动物的健康是有益的［２］。 在 农 业 、兽 医 、医 学 以 及 食 品 工 业［３－４］中 是 很 重 要 的。目前关于乳酸菌应用到乳制品中制成酸奶的 报道很多， 但是对于乳酸菌代谢产物的报道却很 少， 特别对产蛋白酶的乳酸菌尚没有报道。本实验 以实验室保存的 ２１ 种乳酸菌为基础， 对产蛋白酶 的乳酸菌种进行了筛选， 并将所产的蛋白酶进行 了分离纯化， 以期为酸奶的生产研制和微生态制 剂的研发提供更优良的菌种。
图 ９ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 柱层析所得 ４ 个峰对酪蛋白的水解作用结果
由图 ５ 和图 ７ 可以看出， 各峰所在的空周围 并不能明显看到透明圈， 不能确定蛋白酶所在峰 的 位 置 ， 说 明 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ２００ 和 ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ－ ５５Ｆ 并不能将培养液中的蛋白完全分开， 也 得不到相对较纯的蛋白酶。由图 ９ 可以看出， 第 ４ 峰所在的孔周围形成了透明圈， 确定为蛋白酶存 在的位置， 用福林试剂检测法测定第 ４ 峰 ５ 倍浓 缩 液 的 活 性 为 ６．８６ Ｕ／ｍＬ 用 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 检 测 蛋 白酶的纯度和分子质量（ 如图 １０） 。
由表 １ 可知， ５ 号菌种所产的蛋白酶活力最 强， 与酪蛋白平板培养基观察的结果一致。 ２．２ 蛋白酶的分离纯化 ２．２．１ ５ 号菌种粗酶液的 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ （ 分离胶 ８％ 和 ６％） 分析图谱见图 ２ 和图 ３。
由图 ２ 和图 ３ 可以看出， ＭＲＳ 空培养基所在 的泳道没有蛋白存在， 因培养基中的胨分子量太 小， 故 ８％分离胶的 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 没有条带， ５ 号菌 培养基的上清液中有两种蛋白， 一种蛋白的分子 质量在 ３５ ＫＤ 左右， 另一种蛋白的分子质量 在 １５０ ＫＤ 左右。
图 ８ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－ ７５ 过柱结果
３ 讨论
３．１ 产蛋白酶乳酸菌种的筛选方法 在培养过程中， 笔者发现酪蛋白琼脂平板培
养基在培养乳酸菌之前都是透明的， 当培养乳酸 菌一段时间后， 培养基变为乳白色， 这说明乳酸菌 所产生的乳酸将培养基中的酪蛋白变性， 导致培 养乳酸菌后平板培养基呈现乳白色。若某乳酸菌 产生蛋白酶， 则蛋白酶会将此乳酸菌周围的酪蛋 白水解， 导致其周围有透明圈的出现， 从而初步筛 选出产蛋白酶的乳酸菌种。