转抗仔猪腹泻基因_1_盐藻糖转移酶克隆猪的胰岛素样生长因子2表达分析

转抗仔猪腹泻基因α１－盐藻糖转移酶克隆猪的

胰岛素样生长因子２表达分析

窦金焕１，

２，李钟淑２，王雅春１，董易春１，周传丽１，刘铮铸１，３，张勤１，俞英１（１．中国农业大学动物科技学院，

北京　１００１９３；２．延边大学农学院，吉林延吉　１３３０００；３．河北师范科技学院，

河北秦皇岛　０６６００４）摘要：为探求转基因克隆猪存在早期死亡率高及生长发育异常等原因，本研究首次以转抗仔猪腹泻基因α１－盐藻糖转移酶（ｆｕｃｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１，ＦＵＴ１）阳性及阴性克隆猪的脾脏、肝脏及腿肌组织为试验材料，利用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术定量检测影响胎儿及仔猪早期生长发育的印记基因胰岛素样生长因子２（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　２，ＩＧＦ２）的表达情况，并以普通妊娠分娩猪为对照，分析其差异及变化。结果显示，ＩＧＦ２基因在３类仔猪中均存在组织表达差异性，其中肝脏组织中表达量最高，腿肌组织中表达量最低。分析发现，ＩＧＦ２基因在转ＦＵＴ１阳性克隆猪脾脏组织中的表达量显著高于转ＦＵＴ１阴性克隆猪（Ｐ＜０．０５），在腿肌组织中则显著低于阴性克隆猪（Ｐ＜０．０５）。此外，转ＦＵＴ１阴性克隆猪的脾脏、肝脏组织ＩＧＦ２表达量分别极显著低于、高于普通猪（Ｐ＜０．０１）。提示ＩＧＦ２基因的表达变化可能与克隆猪早期生活力弱有关，但与转ＦＵＴ１基因克隆猪早期死亡率高的关系还需进一步研究。

关键词：转ＦＵＴ１基因克隆猪；抗仔猪腹泻；印记基因ＩＧＦ

２；表达差异中图分类号：Ｓ８１４．８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１－７２３６（２０１４）１２－０００１－

０６收稿日期：２０１４－０４－

０４作者简介：窦金焕（１

９９０－），女，内蒙古人，硕士生，研究方向：动物遗传育种。

通信作者：李钟淑，博士，教授，研究方向：动物遗传育种。

Ｅ－ｍ

ａｉｌ：ｌｉｚｓ１９６２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ俞英，博士，副教授，博士生导师，研究方向：动物疾病抗性的表观遗传调控及动物分子抗病育种。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｙｉｎｇ

＠ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ基金项目：国家农业部转基因重点项目资金（２００９ＺＸ０８００９－

１４６Ｂ）；长江学者与创新团队发展计划（Ｉ

ＲＴ１１９１）。 １

９８０年Ｇｏｒｄｏｎ等采用受精卵原核微注射方法将外源基因成功导入小鼠（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ），并获得携带该导入基因的小鼠后代。之后，转基因动物得到越来越多的关注，并相继成功应用于大鼠（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、绵羊（Ｏｖｉｓ　ａｒｉｅｓ）及猪（Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆ

ａ）等物种（Ｈａｍｍｅｒ等，１９８５）。１９９７年，Ｄｏｌｌｙ羊的诞生带动了体细胞克隆技术日新月异的发展（Ｍｃｌａｒｅｎ，２０００）；同年７月，Ｗｉｌｍｕｔ等获得了胚胎细胞克隆与转基因技术相结合的转基因克隆绵羊Ｐｏｌｌｙ

（Ｓｃｈｎｉｅｋｅ等，１９９７；Ｗｉｌｍｕｔ等，１９９７）。至此，转基因克隆技术为高效、低成本获得大量动物提供了可能。尽管如此，目前获得的大部分转基因克隆动物早期生长发育有异于常规生产的动物，突出表现为孕期流产率高、围产期死亡率高、出生后发病率和死亡率高等现象。对于体细胞克隆猪而言，其成活率仅２％～４％。研究发现，印记基因（ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ

ｇ

ｅｎｅ）胰岛素样生长因子２（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃ－ｔｏｒ　２，ＩＧＦ２）的异常表达可能会影响克隆动物胚胎期的生长发育，甚至导致死亡（Ｌ

ａｍｂｅｒｓｏｎ等，１９９６）。ＩＧＦ２基因位于猪的２号染色体上，是一种母源印记、父源表达的印记基因。ＩＧＦ２编码的蛋白是一种重要的内源性胚胎因子，影响胎儿的生长发育，在细胞增殖、分化及细胞程序性死亡过程中发挥着关键作用（Ｌａｍｂｅｒｓｏｎ等，１９９６）。已有研究结果表明，克隆猪ＩＧＦ２基因内含子３的碱基突变、印记控制区的ＤＮＡ甲基化变化等原因，可能影响该基因在克隆猪体内的表达，进而影响胎儿和仔猪阶段的生长发育（Ｆ

ｏｎｔａｎｅｓｉ等，２０１０；Ｚｈａｏ等，２０１３）。仔猪腹泻是猪的常见病及多发病，严重影响现代养猪业的健康发展。研究结果发现，α１－盐藻糖转移酶（ｆｕｃｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１，ＦＵＴ１）基因编码区第３０７位的单碱基突变（Ｇ→Ａ）

是引起仔猪断奶后腹泻与否的致因突变（Ｍａｉｎｉｌ等，２００２）。针对ＦＵＴ１基因，本课题组前期将其抗性基因型ＡＡ型转入易感基因型ＧＧ型猪的基因组内，并利用体细胞克隆技术成功获得１３头转ＦＵＴ１基因ＡＡ基因型的阳性克隆猪（简称转ＦＵＴ１基因阳性克隆猪）及２头未导入该基因型的阴性克隆猪（简称阴性克隆猪）。鉴于１３头转ＦＵＴ１基因阳性克隆猪至断奶时仅存活１头，２头阴性克隆猪１头正常、１头较弱，

本研究以此１５头转·

１·中国畜牧兽医　２０１４年第４１卷第１２期生物技术

ＦＵＴ１基因克隆猪为试验材料，并以自然妊娠分娩仔猪（简称普通猪）为对照，检测印记基因ＩＧＦ２在３类猪不同组织中的表达差异，为分析转基因克隆猪成活率低及生长发育异常寻找原因。

１　材料与方法

１．１　材料

１．１．１　试验动物　试验动物为分娩后３０日龄内的１９头大白仔猪（表１），具体为本课题组前期在北京大兴区某种猪场获得的（Ⅰ）１３头转ＦＵＴ１基因阳性克隆猪（１－１号至１－１３号）、（Ⅱ）２头转基因阴性克隆猪（２－１号、２－２号）、（Ⅲ）对照用的４头普通大白仔猪（３－１号至３－４号）（北京顺义区某种猪场）。宰后立即取脾脏、腿肌及肝脏组织样，－８０℃保存备用。

表１　试验大白猪采样时间表

转基因阳性克隆猪转基因阴性克隆猪普通猪编号存活／采样日龄（ｄ）编号采样日龄（ｄ）编号采样日龄（ｄ）１－１　２０　２－１　２９　３－１　２１－３　２２　２－２　２０　３－２　２１－５　３０　３－３　２１－６　１８　３－４　２１－２、１－９、１－１０、１－１１、１－１２　０

１－４、１－７、１－８、１－１３　２

注：转ＦＵＴ１基因阳性克隆猪中，除１－５号为采样日龄外，其余均为存活时间并即时采样；阴性克隆猪及普通猪均为采样日龄。

１．１．２　试剂及仪器　组织样总ＲＮＡ提取试剂盒（Ｔｒｉｚｏｌ）购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；反转录试剂盒购自

ＴａＫａＲａ公司；荧光定量ＰＣＲ　ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ试剂盒购自Ｒｏｃｈｅ公司。离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；Ａｌ－ｐｈａ　Ｉｎｎｏｔｅｃｈ凝胶成像系统（Ａｌｐｈａｌｍａｇｅｎ公司）；ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司）。其他常规试剂及试验用设备均由中国农业大学材料供应科提供。

１．２　方法

１．２．１　组织样总ＲＮＡ提取及反转录　采用Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒提取１９头试验用猪的脾脏、腿肌及肝脏组织的总ＲＮＡ，每份样本取等量总ＲＮＡ，用反转录试剂盒将其中的ｍＲＮＡ反转录为ｃＤＮＡ。

１．２．２　ＰＣＲ引物　猪ＩＧＦ２基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：３９６９１６）及内参基因ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）的序列从ＧｅｎＢａｎｋ数据库获得，使用Ｏｌｉｇｏ　６．０软件设计并检测引物质量，引物序列见表２。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表２　引物序列信息

基因引物序列（５′→３′）　片段长度（ｂｐ）退火温度（℃）ＩＧＦ２Ｆ：ＣＧＴＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧ　１４６　５８

Ｒ：ＡＧＧＴＧＴＣＡＴＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣ

ＧＡＰＤＨ　Ｆ：ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴ　１０４　５８

Ｒ：ＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＴＡＣＴＧＧＡＡＣＡＴ

１．２．３　引物扩增效率检测　将ｃＤＮＡ模板以１／２至（１／２）５成倍比稀释，共５个浓度梯度，以每个梯度的ｃＤＮＡ作为模板进行实时荧光定量ＰＣＲ，每个梯度重复３次。反应结束后，根据Ｃｔ值及稀释梯度制作标准曲线，检测ＩＧＦ２基因引物对的扩增效率。１．２．４　实时荧光定量ＰＣＲ扩增及相对表达量计算　实时荧光定量ＰＣＲ反应采用ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎⅠ试剂盒，扩增反应体系为２０μＬ：ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ１０μＬ，Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　Ｈ２Ｏ　６μＬ，上、下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，稀释１０倍的ｃＤＮＡ　２μＬ。扩增程序为：９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性１０ｓ，６０℃退火１０ｓ，７２℃延伸１５ｓ，４０个循环；熔解曲线形成：９５℃５ｓ，６５℃１ｍｉｎ，９７℃１０ｓ；最后４０℃１０ｓ。ＰＣＲ扩增结束后，根据目的基因及内参基因的荧光曲线Ｃｔ值，利用公式２－ΔΔＣｔ计算ＩＧＦ２基因的相对表达量。２　结果与分析

２．１　总ＲＮＡ提取及反转录　提取１９头试验猪脾脏、肝脏及肌肉组织的总ＲＮＡ后，分别溶入无ＲＮＡ酶的ｄｄＨ２Ｏ中，电泳检测结果显示，总ＲＮＡ的２８Ｓ、１８Ｓ和５Ｓ３条带清晰整齐，表明没有降解，其中转基因阳性克隆猪部分个体脾脏组织的总ＲＮＡ电泳检测图见图１Ａ。ＮＡＮＯＤＲＯＰ　２０００紫外分光光度计检测表明，所有样品Ｄ２６０ｎｍ／Ｄ２８０ｎｍ均在１．８～２．０之间，Ｄ２６０ｎｍ／Ｄ２３０ｎｍ在２．０～２．２之间，

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·生物技术中国畜牧兽医　２０１４年第４１卷第１２期