异种移植材料中_gal_抗原的研究进展_刘佳
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生物医 Journal of
学工程研究 Biomedical Engineering
Research
2013，32（
1）
：
60
～
64
异种移植材料中 α － gal 抗原的研究进展*
刘佳，盖潇潇，刘成虎，尹玉霞，王昕，侯丽△
( 山东省医疗器械产品质量检验中心，山东省医疗器械生物学评价重点实验室，济南 250101)
近来，为了提高植骨成骨效果，在制备的异种骨 中掺入各种成骨因子制成重组合异种骨或复合异种 骨，应用最多的骨生长因子是骨形态发生蛋白 BMP 家族的成员，免疫抑制剂、抗生素等也可与异种骨复 合，并且在动物实验中已取得了疗效［38 － 39］。重组合 异种骨 RBX 也已获得 SFDA 的批准，用于各类骨创 伤的治疗。
Abstract： As the increase cases of tissue damage and bone loss，transplanting has been widely used as the treatment of the patients． There are facing a problem regarding the shortage of donor corneas，the issue is now beginning to emerge as a worldwide problem． Heterotransplantation has been an active investigative field for human application． However，multiple immune barriers preclude its clinical application． The α － gal epitope is a major obstacle to successful xenotransplantation． The α － gal epitope is a major obstacle to successful xenotransplantation，the expression level of α － gal is important in xenotransplantation． In this review we focus on the pathogenesis of the rejection mechanism of α － gal and recent advances in xenocorneal transplantation．
Key words： α － gal epitope； Xenotransplantation； Natural antibody； Rejection reaction
1引言
由于事故或疾病等各种原因，组织创伤、骨缺损 是临床常见病例，移植是临床上最常用的修复方法 之一。动物组织来源的移植材料，由于其来源丰富， 被广泛应用于移植病例。其中异种生物骨、异种生 物皮肤和异种心包是在异种移植材料中占有很大的 比例。目前市场上已出现多种能应用于临床的异种
4 α － gal免疫反应
先前研究表明，人类血清中有 1% 的 IgG 特异 性作用于 α － gal ，并且在非免疫缺陷人群中此抗体的 含量 更 高［29］。 α － gal 抗 原 类 似 于 人 体 的 B 抗 ctose］，两者只有细 微的差别。B 抗原除了有一个 Galα（ 1，3） Gal 末 端以外，还有一个岩藻糖（ Fuc） 支链末端，并且它 只存在于 B 型血和 AB 型。A 型血和 O 型血个体血 浆中含有的天然多克隆抗 αGal 抗体没有抗 B 抗原 的活性［30 － 31］，但是 85% 的抗 B 抗原的抗体都有抗 αGal 抗原的特性，提示在异源移植手术中应该考虑 供体动物血型的影响。
5 去除 α － gal的现有方法研究
消除异种移植免疫排斥的途径首先是去除其抗 原物质，常用的处理方法有深冻、反复冻融、锻烧、交 联、脱蛋白、照射，或多种方法联合运用。不同处理 方法对异种骨生物学特性与力学特性存在着不同影 响［32 － 34］： 锻烧是采用高温条件处理骨材料，彻底去 除其中的有机质，锻烧条件对异种骨的力学特性及 降解性能有明显 影 响［35］。 脱 蛋 白 是 使 用 脱 蛋 白 剂 如过氧化氢或叠氮化钠处理骨组织，去除蛋白质，抗 原性低，但缺乏骨诱导能力。目前可见的市场化的 Kiel 骨是经过脱脂部分脱蛋白等一系列处理的小牛 骨，抗原性低，但经临床和实验证实，缺乏诱导成骨
腺中也发 现 存 在 α － gal 糖 脂，并 且 在 羊 胸 腺 中 存 在 α － gal 神经节苷脂。在羊、猪和兔的大脑中没有发现 表达 α － gal 糖脂，说明 α － gal 分布是有特异性的［15 。 － 16］ 3． 2 α － gal 糖蛋白
研究发 现 多 种 动 物 的 甲 状 腺 球 蛋 白 中 含 有 α － gal 抗原决定基［17］，其中牛甲状腺蛋白 N － 端连接 有 α － gal 抗原决定基［18］。研究发现，多种动物的纤 维蛋白原、免疫蛋白原和甲状腺球蛋白含有 α － gal 抗 原决定基［19 － 21］。其本质是一组糖蛋白或糖脂类物 质，包括整合素的 α1、α2、α3、α5、αv、β1 和 β3 链， 冯． 威利布兰德因子和纤维结合素（ fibronectin ） 。 其分子量为 115kD、125kD 和 135kD，统称 gp115 / 135，在小鼠［22 － 25］、牛［26］以及猪［27 － 28］组织和细胞中 都发现细胞表面分布 有 大 量 的 α － gal 抗 原 决 定 基。 对猪肾脏中的 α － gal 抗原研究表明，蛋白的 N － 端连 接 α － gal 抗原决定基。免疫组化结果表明，猪肾近曲 小管、呼吸上皮、胰腺、表皮以及血管内皮中均有 α － gal 糖蛋白的表达［27 。 － 28］
摘要： 临床上对于组织损伤、骨缺损等病例，采取移植作为常用的修复方式。虽然自体移植在临床上被 广泛的应用，但是其存在着取材量有限，难以实现大范围缺损修复等原因，异种移植被广泛应用于临床。动 物来源的移植材料存在着天然的免疫原性，能够引起机体的免疫排斥反应。天然异种抗原 α － 半乳糖基抗 原( Galaetosyl α － gal － ( 1，3) － galaetosyl β － 1，4 － N － aeetylglueosaminyl，α － gal epitopes，α ) － gal 是存在于灵长 目以外的哺乳动物体内的主要异种抗原，能够引起人体的免疫排斥反应。因此对异种移植材料中 α － gal 抗原 残留量的评价成为迫切需要解决的问题。我们对 α － gal的基本特点及近来的研究进展进行了总结。
关键词： α － gal抗原; 异种移植; 天然抗体; 排斥反应 中图分类号： R318 文献标识码： A 文章编号： 1672-6278 （ 2013） 01-0060-05
The Expression of α－ gal Epitope in Xenotransplantation
LIU Jia，GAI Xiaoxiao，LIU Chenghu，YIN Yuxia，WANG Xin，HOU Li
62
生物医学工程研究
第 32 卷
能力，效果不满意； Oswestry 骨是完全脱蛋白骨，机 械强度较 Kiel 骨差，植于血运丰富的骨床后发挥作 用； Bio － Oss 骨是不含任何有机成分的生物无机骨， 同高温锻烧骨一样，非常疏松易碎，仅作为骨缺损填 充材料，用于牙周外科小范围骨缺损的修复，发挥传 导成骨作用［36 － 37］。
2 α － gal简述
α － gal 存在于哺乳动物中，包括非灵长类哺乳动 物、狐猴以及新世纪猴。相反，在旧世纪猴、猿类以 及人类中，α － gal 没有分布； 另外，在这些动物中存在 大量的 α － gal 抗体与 α － gal 结合。半乳糖 － α（ 1，3） － 半乳糖（ α ） － gal 在哺乳动物中由 α（ 1，3） 半乳糖基转 移酶（ GT） （ EC2． 4． 1． 151） 催化，主要存在于除人以 外的哺乳动物中。α（ 1，3） 半乳糖基转移酶晶体结 构已经被解析出来，3D 晶体结果表明 α（ 1，3） 半乳 糖基转移酶 C － 端序列形成催化活性区域，催化半 乳糖形成 α － gal 。人类染色体中由于 α（ 1，3） 半乳糖 基转移酶发生变异，因此对于外源性的 α － gal 出现免 疫排斥。之前研究表明，外源性植入猪移植组织时， 人类对猪细胞表面的 α － gal 识别后，α － gal 被人体中的 免疫抗原细胞（ APC） 识别，免疫反应在急性排异期 以及迟发型排异期中均发生作用。
* “十二五”国家科技支撑计划课题( 2012BAI22B01) 。 △通信作者 Email: 512keren@ sina． com
第1 期
刘佳，等： 异种移植材料中 α － gal 抗原的研究进展
61
对于异源性移植来说，排异反应是移植的主要 问题［1］。人体 免 疫 系 统 对 异 源 性 组 织 产 生 排 异 反 应，其中多种细胞及蛋白质参与其中。排异反应包 括两个阶段，第一个阶段是急性排斥阶段（ HAR） ， 在几分钟至几小时内摧毁外来组织。急性排斥阶 段，主要反应发生在血液中，其中血管内皮细胞发挥 主要 作 用［2 － 4］。 另 一 个 时 期 是 迟 发 型 排 斥 反 应 （ DXR） ，此阶段主要是相应的抗原抗体结合反应。 在 DXR 中白细胞，包括单核细胞和嗜中性粒细胞发 挥作用［5 － 6］。天然异种抗原 α － 半乳糖基抗原（ Galaetosyl α － （ 1，3） － galaetosyl β － 1，4 － N － aeetylglueosaminyl，α － gal epitopes，α － Gal） 是存在于灵长 目以外的哺乳动物体内的主要异种抗原，人类不表 达 α － gal ，因此，将其识别为“异已”而产生抗体，激活 补体，通过 NK 细胞杀伤与改变内皮组织表型产生 免疫效应［7 － 8］。
（ Shandong Quality Inspection Center for Medical Devices，Shandong Provincial Key laboratory of Biological Evaluation of Medical Devices，Jinan 250101，PR China）
骨，如 Kiel 骨、Bio － OSS、RBX 重组合异种骨，其治 疗效果显著，安全性也得到认可。但是异种材料面 临着降低其免疫原性，降低移植骨后受体患者的免 疫排斥反应的问题，才能达到能与同种骨有相近的 治疗效果。因此，异种移植材料中免疫抗原含量的 测定及其检测方法的研究，对于异种材料的安全性 和植入性评估至关重要，但是目前还没有相关的对 于各种生物材料中免疫抗原含量测定的系统研究。
异种骨的另一种方法是特异性消除或屏蔽异种 植入物表面的抗原性物质，使得受体对异种抗原不 产生免疫应答，从而避免了植骨后宿主对植骨材料 的免疫排斥。另外转基因技术或基因敲除技术的应 用，对猪的基因改造，使其不表达 a 半乳糖基抗原。 转基因猪、基 因 敲 除 猪 均 已 有 报 导［40］，但 效 果 并 不 理想。
3 α － gal分类及分布
3． 1 α － gal 糖脂 1968 年首次发现，在兔红细胞中存在神经酰胺
戊己糖苷（ CPH） 含有 α － gal 抗原决定基［9］，并且之后 对于 CPH 研究表明存在一系列不同长短糖链的糖 脂，被称为神经酰胺糖苷（ CHH） ，其中都含有 5 个 单糖，其中每个己糖单元形成一个分支［10 － 13］。α － gal 糖脂分布广泛，在羊、猪、兔、牛以及大鼠肾脏组织中 表达［14］，其中只有大鼠不含有中性 α － gal 糖苷，而猪 和羊含有类似的酸性 α － gal 糖苷。在羊、猪以及兔胸
学工程研究 Biomedical Engineering
Research
2013，32（
1）
：
60
～
64
异种移植材料中 α － gal 抗原的研究进展*
刘佳，盖潇潇，刘成虎，尹玉霞，王昕，侯丽△
( 山东省医疗器械产品质量检验中心，山东省医疗器械生物学评价重点实验室，济南 250101)
近来，为了提高植骨成骨效果，在制备的异种骨 中掺入各种成骨因子制成重组合异种骨或复合异种 骨，应用最多的骨生长因子是骨形态发生蛋白 BMP 家族的成员，免疫抑制剂、抗生素等也可与异种骨复 合，并且在动物实验中已取得了疗效［38 － 39］。重组合 异种骨 RBX 也已获得 SFDA 的批准，用于各类骨创 伤的治疗。
Abstract： As the increase cases of tissue damage and bone loss，transplanting has been widely used as the treatment of the patients． There are facing a problem regarding the shortage of donor corneas，the issue is now beginning to emerge as a worldwide problem． Heterotransplantation has been an active investigative field for human application． However，multiple immune barriers preclude its clinical application． The α － gal epitope is a major obstacle to successful xenotransplantation． The α － gal epitope is a major obstacle to successful xenotransplantation，the expression level of α － gal is important in xenotransplantation． In this review we focus on the pathogenesis of the rejection mechanism of α － gal and recent advances in xenocorneal transplantation．
Key words： α － gal epitope； Xenotransplantation； Natural antibody； Rejection reaction
1引言
由于事故或疾病等各种原因，组织创伤、骨缺损 是临床常见病例，移植是临床上最常用的修复方法 之一。动物组织来源的移植材料，由于其来源丰富， 被广泛应用于移植病例。其中异种生物骨、异种生 物皮肤和异种心包是在异种移植材料中占有很大的 比例。目前市场上已出现多种能应用于临床的异种
4 α － gal免疫反应
先前研究表明，人类血清中有 1% 的 IgG 特异 性作用于 α － gal ，并且在非免疫缺陷人群中此抗体的 含量 更 高［29］。 α － gal 抗 原 类 似 于 人 体 的 B 抗 ctose］，两者只有细 微的差别。B 抗原除了有一个 Galα（ 1，3） Gal 末 端以外，还有一个岩藻糖（ Fuc） 支链末端，并且它 只存在于 B 型血和 AB 型。A 型血和 O 型血个体血 浆中含有的天然多克隆抗 αGal 抗体没有抗 B 抗原 的活性［30 － 31］，但是 85% 的抗 B 抗原的抗体都有抗 αGal 抗原的特性，提示在异源移植手术中应该考虑 供体动物血型的影响。
5 去除 α － gal的现有方法研究
消除异种移植免疫排斥的途径首先是去除其抗 原物质，常用的处理方法有深冻、反复冻融、锻烧、交 联、脱蛋白、照射，或多种方法联合运用。不同处理 方法对异种骨生物学特性与力学特性存在着不同影 响［32 － 34］： 锻烧是采用高温条件处理骨材料，彻底去 除其中的有机质，锻烧条件对异种骨的力学特性及 降解性能有明显 影 响［35］。 脱 蛋 白 是 使 用 脱 蛋 白 剂 如过氧化氢或叠氮化钠处理骨组织，去除蛋白质，抗 原性低，但缺乏骨诱导能力。目前可见的市场化的 Kiel 骨是经过脱脂部分脱蛋白等一系列处理的小牛 骨，抗原性低，但经临床和实验证实，缺乏诱导成骨
腺中也发 现 存 在 α － gal 糖 脂，并 且 在 羊 胸 腺 中 存 在 α － gal 神经节苷脂。在羊、猪和兔的大脑中没有发现 表达 α － gal 糖脂，说明 α － gal 分布是有特异性的［15 。 － 16］ 3． 2 α － gal 糖蛋白
研究发 现 多 种 动 物 的 甲 状 腺 球 蛋 白 中 含 有 α － gal 抗原决定基［17］，其中牛甲状腺蛋白 N － 端连接 有 α － gal 抗原决定基［18］。研究发现，多种动物的纤 维蛋白原、免疫蛋白原和甲状腺球蛋白含有 α － gal 抗 原决定基［19 － 21］。其本质是一组糖蛋白或糖脂类物 质，包括整合素的 α1、α2、α3、α5、αv、β1 和 β3 链， 冯． 威利布兰德因子和纤维结合素（ fibronectin ） 。 其分子量为 115kD、125kD 和 135kD，统称 gp115 / 135，在小鼠［22 － 25］、牛［26］以及猪［27 － 28］组织和细胞中 都发现细胞表面分布 有 大 量 的 α － gal 抗 原 决 定 基。 对猪肾脏中的 α － gal 抗原研究表明，蛋白的 N － 端连 接 α － gal 抗原决定基。免疫组化结果表明，猪肾近曲 小管、呼吸上皮、胰腺、表皮以及血管内皮中均有 α － gal 糖蛋白的表达［27 。 － 28］
摘要： 临床上对于组织损伤、骨缺损等病例，采取移植作为常用的修复方式。虽然自体移植在临床上被 广泛的应用，但是其存在着取材量有限，难以实现大范围缺损修复等原因，异种移植被广泛应用于临床。动 物来源的移植材料存在着天然的免疫原性，能够引起机体的免疫排斥反应。天然异种抗原 α － 半乳糖基抗 原( Galaetosyl α － gal － ( 1，3) － galaetosyl β － 1，4 － N － aeetylglueosaminyl，α － gal epitopes，α ) － gal 是存在于灵长 目以外的哺乳动物体内的主要异种抗原，能够引起人体的免疫排斥反应。因此对异种移植材料中 α － gal 抗原 残留量的评价成为迫切需要解决的问题。我们对 α － gal的基本特点及近来的研究进展进行了总结。
关键词： α － gal抗原; 异种移植; 天然抗体; 排斥反应 中图分类号： R318 文献标识码： A 文章编号： 1672-6278 （ 2013） 01-0060-05
The Expression of α－ gal Epitope in Xenotransplantation
LIU Jia，GAI Xiaoxiao，LIU Chenghu，YIN Yuxia，WANG Xin，HOU Li
62
生物医学工程研究
第 32 卷
能力，效果不满意； Oswestry 骨是完全脱蛋白骨，机 械强度较 Kiel 骨差，植于血运丰富的骨床后发挥作 用； Bio － Oss 骨是不含任何有机成分的生物无机骨， 同高温锻烧骨一样，非常疏松易碎，仅作为骨缺损填 充材料，用于牙周外科小范围骨缺损的修复，发挥传 导成骨作用［36 － 37］。
2 α － gal简述
α － gal 存在于哺乳动物中，包括非灵长类哺乳动 物、狐猴以及新世纪猴。相反，在旧世纪猴、猿类以 及人类中，α － gal 没有分布； 另外，在这些动物中存在 大量的 α － gal 抗体与 α － gal 结合。半乳糖 － α（ 1，3） － 半乳糖（ α ） － gal 在哺乳动物中由 α（ 1，3） 半乳糖基转 移酶（ GT） （ EC2． 4． 1． 151） 催化，主要存在于除人以 外的哺乳动物中。α（ 1，3） 半乳糖基转移酶晶体结 构已经被解析出来，3D 晶体结果表明 α（ 1，3） 半乳 糖基转移酶 C － 端序列形成催化活性区域，催化半 乳糖形成 α － gal 。人类染色体中由于 α（ 1，3） 半乳糖 基转移酶发生变异，因此对于外源性的 α － gal 出现免 疫排斥。之前研究表明，外源性植入猪移植组织时， 人类对猪细胞表面的 α － gal 识别后，α － gal 被人体中的 免疫抗原细胞（ APC） 识别，免疫反应在急性排异期 以及迟发型排异期中均发生作用。
* “十二五”国家科技支撑计划课题( 2012BAI22B01) 。 △通信作者 Email: 512keren@ sina． com
第1 期
刘佳，等： 异种移植材料中 α － gal 抗原的研究进展
61
对于异源性移植来说，排异反应是移植的主要 问题［1］。人体 免 疫 系 统 对 异 源 性 组 织 产 生 排 异 反 应，其中多种细胞及蛋白质参与其中。排异反应包 括两个阶段，第一个阶段是急性排斥阶段（ HAR） ， 在几分钟至几小时内摧毁外来组织。急性排斥阶 段，主要反应发生在血液中，其中血管内皮细胞发挥 主要 作 用［2 － 4］。 另 一 个 时 期 是 迟 发 型 排 斥 反 应 （ DXR） ，此阶段主要是相应的抗原抗体结合反应。 在 DXR 中白细胞，包括单核细胞和嗜中性粒细胞发 挥作用［5 － 6］。天然异种抗原 α － 半乳糖基抗原（ Galaetosyl α － （ 1，3） － galaetosyl β － 1，4 － N － aeetylglueosaminyl，α － gal epitopes，α － Gal） 是存在于灵长 目以外的哺乳动物体内的主要异种抗原，人类不表 达 α － gal ，因此，将其识别为“异已”而产生抗体，激活 补体，通过 NK 细胞杀伤与改变内皮组织表型产生 免疫效应［7 － 8］。
（ Shandong Quality Inspection Center for Medical Devices，Shandong Provincial Key laboratory of Biological Evaluation of Medical Devices，Jinan 250101，PR China）
骨，如 Kiel 骨、Bio － OSS、RBX 重组合异种骨，其治 疗效果显著，安全性也得到认可。但是异种材料面 临着降低其免疫原性，降低移植骨后受体患者的免 疫排斥反应的问题，才能达到能与同种骨有相近的 治疗效果。因此，异种移植材料中免疫抗原含量的 测定及其检测方法的研究，对于异种材料的安全性 和植入性评估至关重要，但是目前还没有相关的对 于各种生物材料中免疫抗原含量测定的系统研究。
异种骨的另一种方法是特异性消除或屏蔽异种 植入物表面的抗原性物质，使得受体对异种抗原不 产生免疫应答，从而避免了植骨后宿主对植骨材料 的免疫排斥。另外转基因技术或基因敲除技术的应 用，对猪的基因改造，使其不表达 a 半乳糖基抗原。 转基因猪、基 因 敲 除 猪 均 已 有 报 导［40］，但 效 果 并 不 理想。
3 α － gal分类及分布
3． 1 α － gal 糖脂 1968 年首次发现，在兔红细胞中存在神经酰胺
戊己糖苷（ CPH） 含有 α － gal 抗原决定基［9］，并且之后 对于 CPH 研究表明存在一系列不同长短糖链的糖 脂，被称为神经酰胺糖苷（ CHH） ，其中都含有 5 个 单糖，其中每个己糖单元形成一个分支［10 － 13］。α － gal 糖脂分布广泛，在羊、猪、兔、牛以及大鼠肾脏组织中 表达［14］，其中只有大鼠不含有中性 α － gal 糖苷，而猪 和羊含有类似的酸性 α － gal 糖苷。在羊、猪以及兔胸