分子生药学

第一章绪论

1945年，提出分子生物学一词

1953年，发现DNA双螺旋模型

1983年，提出聚合酶链式反应设想

1985年，发明了聚合酶链式反应

1995年，我国科学家黄璐琦院士首次提出了分子生药学概念

1.分子生药学是在分子水平上研究中药的鉴定，质量的形成及活性成分生产的一门学科。

2.分子生药学的主要研究对象是生物来源药材。

3.分子生药学的任务:

①从分子水平研究中药的鉴定

②在分子水平研究中药的质量形成

③中药活性成分的生物合成与生产

第二章基本技术原理

1变性：在过酸，过碱，加热等理化因素的作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，DNA双螺旋解链变成两条单链。

2.增色效应：在DNA解链过程中，260nm处的吸光度增加，增加量于解链程度呈一定的比例关系，称为DNA的增色效应

3.复性：变性的DNA在适当条件下，两条互补链可以重新恢复天然的双螺旋构象。

4.退火：热变性的DNA在缓慢冷却时发生复性过程。

5.减色效应：在复性的过程中，DNA溶液的OD260值会减少。

6.去除杂质:

①蛋白质和RNA的去除: 温浴结束后加入氯仿:异戊醇比为24 :1。

②多糖和淀粉的去除:如果提取物中多糖和淀粉含量高，可以利用其与DNA在不同盐溶液中的溶解性差异，去除多糖类杂质的目的。

③去除酚类物质。在DNA提取缓冲液中加入防止分类氧化的试剂，如β-巯基乙醇，抗坏血酸，半胱氨酸，二流苏糖醇。

7.DNA质量检测

纯的DNA沉淀为白色干后透明。干后是白色，则说明蛋白质类杂质较多，若呈黄色至棕色，则含有多酚类杂质，若呈胶冻状，则含有多糖类杂质。

DNA质量检测的方法:

①有紫外分光光度法(DNA在260nm处有最大吸收峰，蛋白质在280nm处有最大吸收峰)

②琼脂糖凝胶电泳法。

8.聚合酶链式反应(PCR)

（1）Kary Mullis在1985年提出，并在1993年获得诺贝尔奖。

（2）PCR模拟了DNA复制过程，其特异性主要体现在与靶序列两端互补的寡核苷酸引物上。

（3）PCR反应三步骤:变性，退火，延伸。

①变性:将待扩增的模板DNA加热至94℃，双链解离变成单链。(变性温度低易引发解链不完全，过高导致聚合酶活性有影响，一般为93～95℃，30～60s。)

②退火:温度降至55℃左右，引物与模板结合。(退火温度根据引物的Tm值决定。一般为50～72℃，60～60s,在允许的范围内选择较高的退火温度能够提高PCR反应的特异性。)

③延伸:温度升高至72℃，在DNA聚合酶下，以dNTP为底物，按照碱基互补配对和半保留复制的原则，合成一条新的DNA。(延伸的时间根据待扩增片段的长度来设定。)

9.PCR体系组成：由引物，DNA聚合酶，dNTP，模板，Mg离子，反应缓冲液组成。

10.影响PCR的主要因素

①引物(引物的设计是决定PCR产物特异性的关键)

②DNA聚合酶③dNTP，④模板DNA⑤Mg2+⑥温度参数

⑦循环次数(根据模板DNA的浓度和靶序列的丰度一般为20～40次，尽量减少循环次数)。

11.设计引物遵循的原则:

①长度15～60bp，常为20bp左右。

②最适宜的扩增长度为200～500bp。

③其中G+C含量为40%-60%位宜。过高则扩增效果不佳，过低则易产生非特异性产物，四

种碱基最好随机分布，避免五个以上连续排列的嘌呤和嘧啶核苷酸。

④避免引物内部出现二级结构及两条引物互补的现象。

⑤引物3'端的碱基，尤其最末及倒数第二个碱基需要严格与模板配对，避免由于末端碱基配对不成功，导致PCR反应失败和非特异性扩增。

⑥引物必须与该物种其他DNA序列无明显的同源性。

⑦PCR反应中，每条引物的浓度保持0.1～1umol/L保重，以保证进行特异性扩增的最低引物量，引物浓度偏高，易导致错配及非特异性扩增。

12.PCR技术的种类

①反转录PCR(RT-PCR)②巢式PCR③实时荧光定量PCR（适用于定量检测）

④不对称PCR(关键点在于上下游引物的浓度比例相差较大，其主要产物仍然为双链DNA。多用于制备探针，进行序列分析和核酸杂交)

⑤多重PCR。

13.多重PCR:在同一反应中，利用多组引物，同时对几个不同的DNA片段进行扩中，当其中的某一段DNA缺失，则电泳谱上相应的条带就会消失。主要用于多个突变位点的检测和基因分型。

14.DNA体外重组常用载体:

以原核细胞为宿主的载体主要有质粒载体和λ噬菌体载体。

以真核细胞为素质的载体主要为病毒载体。

15.一种理想的质粒载体应当具备以下条件:

①分子相对较小(可使限制性内切酶在质粒上的酶切位点减少)

②拷贝数较多(可导致克隆的外源基因量增加，一般选择松弛性质粒)

③在复制子以外的适当位点构建几个限制性内切酶的单一酶切位点。最好位于易于检测的表型性状相关基因上。

④赋予宿主细胞易于检测的表型。

16.目前常用两种方法制备载体:

①在这里中构建抗生素抗性基因。以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状。

②利用外源DNA插入质粒转化大肠埃希菌后形成的紧咯颜色变化。

17.DNA连接方式：平末端连接，黏末端连接两种方式。

19.目的DNA与载体重组方法

转化：外源DNA转入宿主细胞并获得新表型的过程。

转导：由噬菌体和细胞病毒介到的转化。

转染：相对于原核细胞，真核细胞导入外源DNA片段获得新表型的过程称为。

20.目的基因表达:

①外源基因的原核表达

常见的原核受体菌有:

1)大肠埃希菌(大肠埃希菌表达系统由启动子，核糖体结合位点和转录终止子三部分构成。)

2)枯草芽孢杆菌3)棒状细菌4)蓝细菌

②外源基因的真核表达

5种表达系统:酵母表达系统，丝状真菌表达系统，昆虫细胞表达系统，植物表达系统，哺乳动物表达系统。

21.DNA变异的来源有三种:基因突变，染色体畸变，基因重组。

22.基因突变:指一个基因内部遗传结构和DNA序列的改变，包括一对或少数几对碱基的缺失，插入或置换而导致的遗传变化。