蝴蝶兰的组织培养综述

蝴蝶兰的组织培养综述

摘要：对于兰科植物选取蝴蝶兰作为代表进行组织培养，包括外植体的选择，灭菌方法，培养基的成分配制，培养条件及缓苗移植方案等。利用组培技术培育培养名贵品种的兰科植物—蝴蝶兰的无病毒植株。

关键词：组织培养蝴蝶兰无病毒植株

蝴蝶兰属是著名的切花种类，全属50多种，蝴蝶兰是单茎性附生兰，茎短，叶大，花茎一至数枚，拱形，花大，因花形似蝶得名。其花姿优美，颜色华丽，为热带兰中的珍品，有“兰中皇后”之美誉。

蝴蝶兰是植物界被子植物门单子叶植物纲天门冬目兰科蝴蝶兰属的植物。主要分布在菲律宾，马来半岛和我国台湾。喜欢高气温、高湿度、通风透气的环境；不耐涝，耐半阴环境，忌烈日直射，忌积水，畏寒冷，生长适温为22~28℃，越冬温度不低于15℃越冬温度不低于15度。

兰花在我国素有“花中君子”之称，具有极高的观赏价值。随着经济的发展，人民对兰花的购买力增加，兰花迅速成为一项产业，并迅速向工业化生产发展，尤其是蝴蝶兰。过去传统的分枝繁殖远远不能满足于市场的需求。为了适应蝴蝶兰事业的发展，可以进行兰花的植物组织培养来满足人们的需求。

一.培养部位：

大多数植物根、茎、叶和花器等各个部位都能培养成功。而兰科植物可以培养的部位主要是顶芽和侧芽，一部分种类可以采用隐芽等休眠芽，个别可从叶片培养得植株，各属适宜培养的部位也有区别。

1.新芽的茎尖

茎尖是细胞分裂最旺盛的部分，也是培养成功率最高的部位，但需要较高的分离技术。

2.休眠芽

在顶芽失去发芽力时它能发芽。其芽裸露，故分离技术简单。但易污染，所以要注意灭菌。

3.茎的隐芽

茎的隐芽是较难分离的芽，其成活率与休眠芽差不多。

4.花梗

当兰花开花约一个月后，剪取其花梗顶端及若干个花梗腋芽，切成2～3cm长的切段，每段带一腋芽，基部向下插于培养基中。

二.外植体的选择：

蝴蝶兰的茎尖、茎段、叶片、花梗侧芽、花梗节间、根尖等部位都已有培养成功的报道，方法各异，难度各有高低。蝴蝶兰不同外植体的成活率有差异，其中花梗侧芽的成活率最高，达75%；其次为花梗，成活率为 62.5%；叶片和根尖最差，分别为12.5%和7.5%。

针对不同外植体，取材方法也不同，正在生长中的芽是最理想的培养采集物，一般取2～6cm大小切取下来，上面包括有数个隐芽和生长芽。生长芽是培养成功率最高的部位，休眠芽剥起来较困难，生长也较慢。

三.灭菌：

切下后，先充分用流水冲洗，并把最外面的l～2片苞叶去掉，再用10％次氯酸钠（NaClO）或漂白粉溶液(10g漂白粉溶解于140 ml水中，充分搅拌匀后，静置之约20min，取上清液)中浸10～15min。灭菌的时间和灭菌的浓度应根据芽的大小和成熟度用不同种属进行调整。

灭菌后的芽应放在无菌条件下进行剥离和切割，卡特兰类容易产生褐变，在切割时应将芽放在无菌水中操作，这样会比在空气中褐变的机会少些。以消除病毒为目的时要尽量小些，可以小到0.1mm：若以繁殖为目的，培养物可在2～5mm左右。大体积的剥离可以肉眼直接操作，太小时需要在解剖镜下才能看清。

四.基本培养基的选择：

蝴蝶兰组织培养所采用的基本培养基包括

MS、1/2MS、VW、B5、KC、花宝及其改良型等，其中1/2MS对蝴蝶兰原球茎增殖效果最好。

1.外源激素的选择

目前常使用的外源激素主要是生长素类（如IAA、2,4-Ｄ和NAA）和细胞分裂素类（如BA、ZT、KT）。蝴蝶兰组织培养中常用的细胞分裂素为 6-BA，较高浓度（1~ 8mg/L）的 6-BA能促进蝴蝶兰原球茎增殖，较低浓度（0.1~0.5mg/L）的 6-BA 则能促进原球茎分化。适宜浓度的 6-BA 配合较低浓度的NAA，更有利于原球茎的增殖，2.0mg/L 6-BA 和 0.3mg/L NAA配合使用是蝴蝶兰原球茎增殖的最佳组合。

2.培养基添加物对蝴蝶兰增殖和分化的影响：

蝴蝶兰组织培养中常加入一些天然物质如椰乳、香蕉泥、番茄汁、苹果汁等，这些物质能提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等，如加入10 0~200mg/L香蕉泥，具有较大的 pH 缓冲作用，有利于兰科植物的壮苗和生根。许多资料也表明，添加适量的香蕉泥、椰乳或含胶质的果菜汁等均对原球茎增殖有明显促进效果。

适量的添加物对蝴蝶兰丛生芽的诱导和生根也有一定的促进作用。培养基中添加活性炭，低浓度（0.5~1.0g/L）时对原球茎增殖影响不明显，但可促进蝴蝶兰生根；高浓度（2.0~3.0g/L）时对原球茎增殖有促进作用，但原球茎有黄化现象。蔗糖作为培养基的能源物质和渗透调节剂，对原球茎的增殖生长影响较大。蔗糖含量为 2%时，原球茎分化速度最快；蔗糖含量为2%~3%时，促进芽的形成；蔗糖含量为5%时，有利于根的分化和生长。蔗糖含量为3%~5%时，抑制原球茎的分化和生长，分化质量和分化速度都显著下降。

五.接种：

茎尖接种以固体培养基为好，但因属而异，如蕙兰属在培养基培养形成原球茎，以后则用固体培养基进行继代培养，而卡德兰属和石斛属这一类易变褐枯死的属，以在液体培养基为好。

六.培养：

接种后l～2个月培养的茎尖即可形成原球茎球状体，以后即发芽生根长叶。应在其发芽前把它切成小块进行转移，让它继续不断地形成原球茎球状体。这样连续的进行继代培养，短时间可以得到大量的原球茎球状体，方法是从培养基中取出原球茎球状体，在灭过菌的培养皿内，用灭过菌的解剖刀将其切成小块，再接种到培养基中。

1.在兰花茎尖培养中，要求有四种培养基：

(1)适于形成原球茎的初代培养基是从芽上剥出的生长点直接接种用的培养基，对于许多兰花来说，Ms培养基最好。另外KnudsonC(KC)培养基也不错。

(2)适于繁殖原球茎的继代培养基虎头兰用KC+10％椰乳的液体培养基，在KC+ NAA 1+Kt0.01固体培养基也有较好的结果。卡特兰可用MS+NAA1+BA5。

(3)适于原球茎分化的培养基一般来讲原球茎分化苗是比较容易的，通常用基本培养基培养，就能分化幼苗和根。

2.液体振荡培养：

采用旋转振荡机进行液体振荡培养，保持22℃的恒温，24h连续照明，可得到大量的原球茎球状体。应用这个方法，有利于大量繁殖原球茎球状体。液体培养一天进行2～3次振荡就可解决氧和营养的供应问题，也可达到使组织极性消失的目的。用1～2次／分的自动振荡，累计1天达几个小时。振荡旋转形成的原球茎球状体的凹面少，多成为近圆形的组织块。故旋转不要太快为好。

从液体培养基往固体培养基的转移，因由液体培养基形成的原球茎状体体积较大，可切成10块以上的小块转移到固体培养基，繁殖形成茎叶和根。以后由于长出的幼苗较多，发育不良，可在茎叶5～l0mm长时从试管内取出，在培养皿内将苗分开。再进行培养，可得到整齐优良的苗。

3.原球茎继代中褐化的防治：

蝴蝶兰和其它兰科植物一样，原球茎状体在继代培养过程中易褐变死亡，不易增殖。在培养基中添加1~2g/L活性炭，适时切除培养物的褐化部分并及时更换新鲜培养基，能有效抑制外植体褐变死亡；培养基中加入10%椰子水，也能促进原球茎的生长，减少原球茎增殖过程中的褐变。蝴蝶兰的群体效应很明显，单芽容易褐化死亡，且增殖较慢，因此，刚诱导出的原球茎状体不能过早切割转移，在继代阶段接种时，应尽量避免切成单芽，增殖时切块也不宜过小，否则容易褐化死亡。6~8月份高温季节采芽排出的褐变物质多，成活率也最低，所以要避免在夏季采芽。

4.外界条件对蝴蝶兰的影响：

培养基的pH值直接影响培养物对离子的吸收，过酸或过碱都对植物材料生长有很大影响，此外，琼脂培养基的pH还影响到凝固情况。原球茎在pH值5.0~5.4的环境中生长最好，丛生芽的诱导与增殖在pH值5.6~5.8的环境中较好。

蝴蝶兰在组织培养中，通常都以日光灯为光源，因此，可以人为地进行控制其光照强弱。光照强度对试管苗发根和生长势均有明显的影响。光照为3000lx对蝴蝶兰根诱导和植株生长有利。

在诱导蝴蝶兰丛生芽过程中，由于所取的花梗芽为花芽，在培养过程中，较低的温度影响（15~22℃）会使大部分花梗芽发育成花芽；在较高温度（23~26℃）下培养，花梗花芽转化为营养芽，所以在进行蝴蝶兰丛生芽诱导时的适宜温度条件为（25±２）℃。

七.生根壮苗及移栽: