酪氨酸酚裂解酶的固定化与转化条件的优化

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微生物学杂志 2019年 2月第 39卷 第 1期 JOURNALOFMICROBIOLOGYFeb.2019Vol.39No.1
酪氨酸酚裂解酶的固定化与转化条件的优化
马文静1,2,3,周景文2,3,徐国强1,2,3
(1.江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏 无锡 214122;2.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室, 江苏 无锡 214122;3.江南大学 生物工程学院,江苏 无锡 214122)
Abstract Inthisstudy,arecombinedE.coliBL21carryingtyrosinephenollyasederivedfromErwiniaherbicolawas usedasaresearchobjecttostudytheconditionsforLtyrosineproductionbyimmobilizingE.coli.Usingsodiumalgi nateascarrier,theeffectsofthegelatinconcentration,reactiontime,gelatinandadjuvant(silicondioxide,diatoma ceousearthandcalcium carbonate)onLtyrosineproductionwereinvestigatedrespectivelyadoptingsinglefactorex periment,itwasfoundthattheeffectsofgelatinconcentration,reactiontime,thephenolconcentrationandcalcium carbonateandotherfactorswerecomparativelysignificant.Thentheoptimalconditionswereexploredbyorthogonal experiments.TheresultsshowedthatthemostoptimalLtyrosineproductionconditionswere4% sodiumalginateand 6% gelatinasmixedcarrier,0.08mol/Lphenol,8hoursreactiontime,and0.6% calciumcarbonateaddedtothe carrier,undertheseconditionstheoutputofLtyrosinewasat64.5g/Lafter9consecutivereactions,increasedby 451.3% higherthanthatbeforeoptimization. Keywords Ltyrosine;tyrosinephenollyase;immobilizedtechnology;sodium alginate
OptimizationofImmobilizationandTransformation ConditionsforTyrosinePhenolLyase
MAWenjing1,2,3,ZHOUJingwen2,3,XUGuoqiang1,2,3
(1.Natl.Engin.Lab.forCerealFerment′n.Technol.,2.KeyLab.ofIndust.Biotech.,Minist.ofEduc., 3.Schl.ofBiotech.,JiangnanUni.,Wuxi214122)
摘 要 以欧文氏菌(Erwiniaherbicola)来源的酪氨酸酚裂解酶的重组大肠埃希菌 EscherichiacoliBL21为研 究对象,研究固定化大肠埃希菌生产 L酪氨酸的条件。以海藻酸钠为载体,采用单因素实验分别考察了载体 材料、明胶浓度、反应时间、苯酚浓度和辅助剂(二氧化硅、硅藻土和碳酸钙)等因素对 L酪氨酸生产的影响, 发现明胶浓度、反应时间、苯酚和碳酸钙等因素的影响较为显著,进而通过正交实验探索最优条件。结果表 明,生产 L酪氨酸的最优条件:载体为 4%海藻酸钠与 6%明胶的混合载体,苯酚浓度 0.08mol/L,反应时间 8 h,于载体中添加 06%碳酸钙。此条件下,连续反应 9次后 L酪氨酸的产量达到 64.5g/L,比优化前提高了 451.3%。 关键词 L酪氨酸;酪氨酸酚裂解酶;固定化技术;海藻酸钠 中图分类号 Q814 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2019)01-0026-06 doi:10.3969/j.issn.1005-7021.2019.01.004
1期 马文静等:酪氨酸酚裂解酶的固定化与转化条件的优化
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Байду номын сангаас
的传递有重要关系[3]。它常被用来治疗忧郁症, 甲状腺机能降低,也有助于细胞长久保持年轻化, 提高身体免疫力。随着基因工程技术和酶工程技 术的发展,生物合成 L酪氨酸将具有更加广阔的 应用前景。固定化细胞是将具有生理功能的微生 物细胞包裹在水不容的载体里,使其可循环利用, 不断反应 发 酵 的 一 种 技 术,广 泛 应 用 于 食 品、医 学、制药、化学分析、环境保护、能源开发等多种领 域[45]。1989年,赵景联[6]通过固 定 化 大 肠 埃 希 菌来生产 γ氨基丁酸,可以使 95%的谷氨酸被转 化成 γ氨基丁酸,也有人以聚乙烯醇作为固定化 载体生产 α淀粉酶[7],还有通过固定化来生产乳 酸[8],用 2%的海藻酸钠固定乳杆菌,可以让固定 化球保持 150h的完整性,没有破碎,使 L乳酸的 产量达到 45g/L。本研究采用固定化细胞的方 式,用全细胞酶法技术,充分利用酶活以获得高产 量的 L酪氨酸。常用的固定化方法主要有吸附 法、共价法、交 联 法 和 包 埋 法 等 [910]。 L酪 氨 酸 的 制备方法有 3种:一种是从含有蛋白质的物质(酪 蛋白和玉米等)水解液中提取获得;一种是以葡萄 糖为原料,以短杆菌突变育种发酵生产获得;最后 一种是以苯酚、丙酮酸和氨为底物利用酪氨酸酚 裂解酶进行酶法催化生产。而最早对于酶法合成 L酪氨酸由 Yamada和 Kumagai进行 了研究[11]。 酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenollyase,TPL),也称 β酪氨酸酶,是 依 赖 于 磷 酸 吡 哆 醛 (PLP)的 多 功 能酶,该酶 能 够 催 化 一 系 列 的 反 应。 TPL在 生 物 体外可将丙酮酸、氨和苯酚转化产生 L酪氨酸,在 生物体内可将 L酪氨酸催化生成氨、丙酮酸和苯 酚。该酶主要分布于肠细菌内,也存在于一些嗜 热菌和节肢动物体中,其中酶活较高的微生物主 要是弗氏柠檬酸菌 (Citrobacterfreundii)、草 生 欧 文氏菌(Erwiniaherbicola)以及嗜热菌(Symbiobac teriumthermophilum)等[1213]。关于酶法合成 L酪 氨酸的 研 究 已 有 较 多 报 道[1415],另 外,常 俊 俊 等[1617]利用 TPL全细胞催化丙酮酸或者 L丝氨 酸合成酪氨酸,以 0.1mol/L丙酮酸和 0.1mol/L 苯酚为底物,反应 24h后,酪氨酸产量为 16.17g/ L,转化率达 78.6%。本研究考虑到固定化细胞 具有可循环利用、易于制备和分离等优势,将固定 化细胞技术与酶法生产 L��
L酪氨酸是 20种氨基酸中的一种,对人和动 物的生长发育及新陈代谢起着重要作用,常作为 营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸及以
多巴、对羟基苯乙烯等医学化工产品的制备原料, 广泛应用于食品、医药和日化等领域[12]。酪氨酸 也是构成甲状腺素的重要成分,酪氨酸与神经元
基金项目:国家自然科学基金重大项目(21390204) 作者简介:马文静 女,硕士研究生。研究方向为发酵工程。Email:603544098@qq.com 通讯作者。男,博士,副教授,硕士生导师。研究方向为发酵工程。Tel:051085328761,Email:xuguoqiang@jiangnan.edu.cn 收稿日期:20180427
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