微生物和基因工程

PCR 由 3 个基本反应组成。 ① 变性: 加热，模板 DNA 经热 变性，成为两条单链； ② 退火: 使温度下降，寡核苷酸引物 即与模板 DNA 中所要扩增序列两端的碱基配对； ③ 延伸: 在 适宜条件下引物 3‘ 端向前延伸，合成与模板碱基序列完全互 补的 DNA 链。

DNA 片段以 2 的指数增长，重复 25~30 次循环，扩增的 DNA 片段拷贝数可增至 10 6 -10 7 倍。

这类载体不需要标记基因，因为空载的载体DNA 只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细 胞中去。
λ噬菌体载体的优点

可在体外包装成噬菌体，高效感染大肠杆菌 装载外源DNA的量大（≤23kb） 重组λ-DNA的筛选提取方便 λ噬菌体载体常用于构建基因文库。
三、 M13噬菌体载体
2. cDNA文库构建

所谓cDNA文库是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。
cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。

由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的 库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但基于这样 一个事实，即细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数 小得多（通常大约仅有15%左右基因被表达），因而若由

三项重要技术为基因工程奠定了基础:
1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶
为基因工程提供了有力的工具；

1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重 组成功；1973年Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大 肠杆菌，实现了DNA的分子克隆; 1977年Boyer等首先将人
1985
第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国
基因鱼
转
1993
基因工程西红柿在美国上市
1997 英国罗斯林研究所-克隆羊多莉 1999.9 中国获准加入人类基因组计划, 负责测定人 类基因组全部序列的1% 2000.6.26 2001.2.11 科学家公布人类基因组工作草图 公布人类基因组基本信息
第一节 基因工程概述
PCR 技术的实际用途
① 可用于 DNA 的扩增和克隆，制备单链或双链 DNA 探针；也可用于定位诱变和 DNA 测序。
② 在临床医学上可用于检测病原体，诊断遗传病，
以及对癌基因的分析确定。 ③用于法医,以鉴别个体和判定亲缘关系。
基因诱变

寡核苷酸介导的突变 盒式诱变 PCR介导的突变
（2）用限制性酶部分水解或机械剪切成适当长度的DNA
片段，经分级分离选出一定大小合适克隆的DNA片 段； （3）选择容载量较大的克隆载体，通常采用λ噬菌体或 柯斯质粒载体，在适当位点将载体切开；
（4）将基因组DNA片段与载体进行体外连接；
（5）重组体DNA直接转化细菌或用体外包装的重组λ噬 菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组 DNA的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。
组DNA分子；
3、转化：重组DNA分子导入细胞。
4、扩增该克隆DNA。 5、筛选与鉴定； 6、基因表达：控制适当条件，外源DNA表达。 7. 获得表达产物或转基因动物、转基因植物。
二、微生物与基因工程关系
一切基因工程操作都离不开微生物 1、基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造 而成的。 2、基因工程所用千余种工具酶是从微生物中得到的。
核酸酶
反向转录酶
水解酶，非专一性
逆转录酶
一、限制性内切酶
1、限制性内切酶的定义
pBR322的结构特征

环状双链DNA分子，由4361bp组成，松驰型; colEⅠ复制起点，外源DNA大小为5kb左右;

四环素抗性基因（Tetr）、氨苄青霉素抗性基因
（Ampr）;

24单一酶切位点（ Tetr中7个， Ampr中3个）。
二、λ噬菌体克隆载体
λ噬菌体克隆载体的构建

1、 M13 噬菌体基本特点： （1） M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染 宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体 颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂；
（2） M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组
成； （3）在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿 主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制， 因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form

聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction, PCR ），是一种在体外快速扩增特定 DNA 序列 的新技术。
http://www.bbioo.com/video/2006/351.htm
PCR 扩增技术原理

如果 DNA 片段两端的序列是已知的，则先要合成一对寡聚核
苷酸引物，它们各自与所需扩增的靶 DNA 片段的末端互补。
3、微生物细胞是基因克隆的宿主。
4、大规模表达基因产物，构建工程菌，利用工厂发酵来实现。
5、提供基因资源（抗高温、高盐、高碱、低温等特性）。
6、模式生物提供基础理论。
第二节 基因的分离合成和诱变

利用重组DNA技术，可将某一原核生物或真核 生物染色体基因组的全部遗传信息，贮存在由
重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因
2.真核生物病毒载体
（1）哺乳动物病毒载体：目前利用许多哺乳动物病
毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等
改造后的衍生物作为基因载体。
（2）昆虫病毒载体：主要为高克隆容量（100kb）； 其次具有高表达效率（25％）；安全，仅感染 无脊椎动物； （3）植物病毒载体
五、人工染色体
酵母人工染色体（YAC）：能容纳最大外源DNA片段。 1、组成：着丝粒（centromere，CEN）、端粒（telomere，
含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克
隆载体可选用质粒或病毒载体。
基因的化学合成
DNA 的合成

自 DNA 合成仪问世后，化学合成已可完全自动化， 在半个小时内可合成 30~35 个碱基的寡核苷酸。

目前化学合成寡核苷酸片段的长度约为 150~200 个 核苷酸左右。
PCR 扩增技术的原理和应用
3、有可供选择的遗传标记（抗性基因、显色反应），
以便于对阳性克隆的鉴别和筛选。
4、具有一定安全性，在胞内不发生重组与转移，在
胞外不发生不能自由扩散。
目前克隆载体种类

质粒载体
Leabharlann Baidu

λ噬菌体载体
柯斯质粒载体


M13噬菌体载体
真核细胞的克隆载体

人工染色体。
一、质粒载体
1、特点：
（1）具有独立复制起点；
mRNA逆转录为cDNA，那么所构建的cDNA文库的库容量
相应比基因文库小。
构建cDNA文库的主要步骤：
①从生物体或细胞中提取mRNA。 ②利用逆转录酶以寡聚(dT)或随机寡聚核苷酸为引物合
成cDNA的第一条链。
③利用DNA聚合酶I，以cDNA第一条链作为模板，用适 当引物合成cDNA第二条链;常用RNA酶H在杂交分子 的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物; 或是除去杂交分子的mRNA后，加入随机引物，即可 合成第二条链。 ④cDNA与载体的体外连接。 ⑤噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于cDNA不
野生型λDNA包装的上限为50.5kb，本身长度为48.5kb， 插入片段至多为2.0kb，如果将其缩短便能够提高装载量。

插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须是唯一的；
取代型载体在取代位点有两个酶切口，多了也不行，而天 然的λDNA上有许多重复的酶切口，如：EcoRI 5个， HindIII 7个，这些多余的酶切口必须被删除
成酶基因3）。 ② 细胞中拷贝数：酵母中高拷贝数。
（2）复制质粒

含有：来自细菌质粒pBR322的复制起点；氨苄青
霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因
（Tetr）。来自酵母染色体的自主复制序列 （ARS）；作为酵母选择标记的URA3基因和TRP1 基因（色氨酸合成酶基因1）。

这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆菌或酵母细胞中 复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数 的质粒。
DNA） ，即 RF DNA ；
四、真核生物的克隆载体

利用真核生物作为克隆载体宿主具有两个重要意 义。 第一，它促进了对真核生物复杂基因组及其基因 调控的研究； 第二，它有利于真核基因产物的翻译后加工。



酿酒酵母是一种理想的真核生物克隆载体宿主。
1.酵母质粒载体
酵母质粒载体都是利用其2μm质粒和其酵母染
色体组分与细菌质粒pBR322构建而成的。可
分别在细菌、酵母中复制，又称穿梭质粒。
主要有三种：附加体质粒、复制质粒、整合质粒
（1）附加体质粒 （episomal plasmid）
① 结构：pBR322的复制起点、Ampr（氨苄
青霉素抗性基因）；2μm的复制起点；酵
母选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合
（3）整合质粒

含有：来自pBR322的复制起点；氨苄青霉素抗性
基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tetr）。来自
酵母的URA3基因；它既可以作为酵母细胞的选
择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。

这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细
胞中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合
到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。
（2）具有较小的相对分子质量。1－200kb，外源DNA≤15kb； （3）具有较高拷贝数，多为松驰控制型。人为增加拷贝数可用终 浓度10－20μg/ml，氯霉素停止细胞蛋白合成，宿主DNA合成 终止，质粒复制正常进行，可达数千个拷贝；
（4）具有便于选择的标记；
（5）易于导入细胞，质粒可通过转化和电穿孔等方法导入细胞； （6）具有限制酶单一识别位点。
文库(genomic library)或cDNA文库(cDNA
library)
1. 基因文库的构建

所谓基因文库是指生物染色体基因组各DNA片 段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因 组中某一特定的DNA片段。

一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因 组全部遗传信息（即全部DNA序列）。
2、基因文库的构建步骤： （1）从组织或细胞提取基因组DNA；
第三节
微生物与克隆载体
载体：克隆载体、表达载体、穿梭载体
克隆载体：外源DNA片段进行克隆，需要一个合适
的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增。这
种以扩增外源DNA为目的载体，称为克隆载体。
克隆载体应具备的性质
1、可独立自主复制，具备复制原点； 2、具有若干限制酶单一切割位点，且位于载体复制
的非必需区，以便插入外源基因后不影响复制。
I 插入型载体

经改造后的长度为37kb，为包装的下限，
插入片段最大为13.5kb（50.5-37kb）

由于该类载体重组与否均可包装，因而为 区分组子与非重组子必须携带标记基因。
II 取代型载体

经改造后的长度约为40kb，含两个酶切口，两者 间的距离为14kb，然后用外源DNA片段取代之。 包装下限为37kb，
工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成
功地在大肠杆菌中合成得到这14肽；

1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后发明了三种DNA 序列的快速测定法；90年代全自动核酸序列测定仪的问世；
一、基因工程基本过程
1、目的基因的提取：分离或合成外源基因。
2、体外重组：外源基因与载体体外连接，构建重
第 十 章
微生物与基因工程
基因工程技术

基因工程（genetic engineering)：把分离到的 或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿
主细胞内，使其扩增和表达，从而得到大量基
因产物，或令生物表现出新的形状。
基因工程大事记
1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌， 实现了DNA的分子克隆; 1978 Genentech公司---人胰岛素---世界上第一种基 因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获 准使用
TEL）、酵母自主复制序列（ARS）、选择性标记（如
URA3）。 2、功能：大片段克隆（100万bp），多用于真核生物基因库的载 体。 3、相关：细菌人工染色体（BAC）。
第四节

微生物与基因工程工具酶
常用工具酶种类 内切酶 把DNA长链切割为短的片段 连接酶 聚合酶 末端转移酶 将2段DNA片段拼接起来 催化合成形成核酸链 片段末端加接多聚核苷酸