分子细胞遗传学新进展
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centromere
telomere subtelomere whole chromosome paint
locus specific
FISH技术的特点
操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合， 可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析 方法敏感，能迅速得到结果，24小时就可以完成检测 人员培训较快
细胞遗传学技术的步骤
细胞遗传学技术的步骤
细胞遗传技术的步骤
有丝分裂—中期的核型分析
染色体组核型分析
• G-带 (Giemsa) – 富含AT的区域颜色较深 – 优点 • 能看到整个基因组 • 显示每一单个染色体 – 缺点 • 分辨率(5-10Mb) • 进行细胞培养 • 其他会用到的核型分析技术 – R, Q, C, 和 NOR 带
美国，每年5O～75岁无症状的男性进行直肠指 诊(DRE)、PSA检查
当 PSA>10ng/ml时 患癌的几率在50%以上 当PSA为 4～10ng/ml，考虑穿刺活检进一步证实，仅 能发现20～40%的 PCa患者,漏诊率高 当PSA<4ng/ml，不主张做穿刺活检，但近年来发现当 PSA为2～4ng/ml时，20～30% 的患者也发现有PCa PSA作为PCa血清学标记不能有效地区分早期PCa和前 列腺增生，特异性低，特别是当 PSA为2～10ng/ml 时， 有必要研究新的早期PCa诊断方法，有效地筛查出 PSA在2～10ng/ml范围内的PCa
• 肾癌/肾盂癌鉴别诊断, 血尿鉴别诊断(移行上皮细 胞肿瘤早期诊断) 和移行上皮细胞肿瘤治疗后病 程监测的有效手段
前列腺癌(Pca)
一种老年男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤
发病率
发达国家高于发展中国家 欧美：前列腺癌居男性恶性肿瘤的第二位，死亡率 仅次于肺癌 我国：发病率呈上升趋势，已高居泌尿系肿瘤的第 三位，并且发病年龄也日趋年轻化，临床上已经将 其作为老年男性常见恶性肿瘤之一
三种检测方法比较
方法
形态学检测
特异性（％） 敏感性（％）
90 55-80
HPV检测
64－95
84-100
FISH
90
90
• TERC（人类染色体末端酶 ）基因定位在3q26.3 ，该基因的扩增可阻 止细胞凋亡，导致肿瘤产生 • 宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号 染色体长臂扩增。其中，涉及到的最重要的基因可能是TERC基因。该 基因扩增能准确区分宫颈细胞高度癌前病变与低度癌前发育异常，鉴 别诊断的敏感性及特异性均在90%以上；同时，这一扩增也能预测52% －96%的癌前病变有恶变的可能 • hTERC基因扩增的检测极有助于宫颈癌的筛查及早期诊断 • 检测这一基因扩增的标准方法即为FISH技术
临床表现变化多样，其自然发展规律无法预测 晚期可侵及尿道或膀胱颈，引起梗阻症状或刺激症状， 如尿频、尿急、尿线变细等、血尿亦较常见
PCa早期难以察觉, 患者很少引起症状，细胞病理学 改变不典型，诊断易受病理检查者主观的影响
早期诊断成为治疗和判断预后的关键
PCa临床诊断方法
直肠指诊（DRE） PSA抗原筛查 经直肠超声引导穿刺活检
No lesion seen Repeat Pap at 6, 12 months, or HPV testing at 12 months
Cervical pre-cancer or cancer
Treat
• 传统巴氏细胞学涂片&液基薄层细胞检测(TCT） • HPV病毒检测 • 荧光原位杂交（FISH）检测
荧光原位杂交技术(FISH)
荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization，FISH） 生命科学中的“钓鱼” 技术
基本原理：应用荧光染料标记探针DNA，变性成 单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交， 在荧光显微镜下观察并记录结果。
着色探针 着丝粒探针 位点探针
分子细胞遗传学新进展
传统的细胞遗传学
细胞遗传学主要研究染色体的 亚显微结构和基因活动的关系
细胞周期的阶段
简 介
• 60年代早期
• 局限于计算染色体的数目 • 粗略的将染色体按照大小和着丝粒位置进行区分 ( groups A to G)
• 1970年
• 显带技术的建立 • 清楚的分辨出46条染色体
染色体异常 数目改变
• 三倍体 和 四倍体 • 非整倍体
– +21, +18, +13, XO, XXY, 等
染色体异常 结构异常
• 平衡改变 – 易位和 倒位 • 不平衡改变 – 缺失, 扩增, 环状染色体, 和等臂染
色体
倒位
扩增和环形染色体
染色体缺失
• 缺失 – 看得见的 – 识别起来相对容易 • 微缺失 – 看不见 – 识别起来不是很容易
正常 ASCUS
CIN1 CIN2 CIN3
PapI，PapII PapIIw，PapIII
PapIIID
PapIVa，PapIVb PapV
肿瘤
肿瘤
鳞状细胞癌为主，约占95％；腺癌仅为5％左右； 腺鳞癌少见，但恶性度最高，预后最差。
传统的宫颈癌检查及诊断程序
Cervical Pap screening
数量
发生率
唐氏综合症
• • •
21号染色体三体, 95-97% 多余的染色体来自母亲, 唐氏综合症与母亲的年龄有关系, 确切的病因不 是很了解. 活产新生儿发病率为1 /800 to 1 /1,100 , 唐氏综合症与文化、种族、社会阶层以及地理区域都没有 必然的联系。 智能较正常儿童低，认知困难，发育迟缓。他们也有很特殊的面貌，通常双眼距离较远、眼睛向上 斜、鼻梁骨平坦，嘴、牙齿及耳朵均细小。肌张力低。
Normal Repeat Pap 4 to 6 months
ASC-US HPV Testing HPV positive (high-risk type)
ASC-H
LSIL
HSIL
or
HPV negative (high-risk type)
Colposcopy Repeat Pap 12 months
• 行为危险因素 性生活过早、多个性伴侣、多孕多产、社会经济 地位低下、营养不良及性混乱等 • 生物学因素 细菌、病毒和衣原体等各种微生物的感染
子宫颈癌
细胞学分级
Bethesda分级
宫颈内膜新生物 （CIN）
Pap 分级I-V（德国使 用）
正常 ASCUS（非典型性鳞状上皮 增生）
LSIL（低级鳞状上皮化生） HSIL （高级鳞状上皮化生）
细胞遗传学的一般步骤
• • • • • • • • • • 细胞培养 使细胞停留在分裂中期 低渗的方法使细胞膨大 固定染色体，保留核酸 将细胞滴到玻片上 用显带染色技术进行染色 在荧光显微镜下分析染色体 数20个中期分裂相进行分析 常规研究方法可区分400-600条带 高分辨率研究方法可区分>650条带
前列腺癌检测新发现
• 80%左右PCa存在TMPRSS2与ETS 家族的融合改变
子宫颈癌检查
膀胱癌
• 细胞学检查
– 灵敏度( 大约 50-60%), 特异性 ( 大约 98%)
• 膀胱镜检查
– 侵入性
• 膀胱肿瘤抗原
– 灵敏度较高, 但特异性比细胞学要低
膀胱癌检测新发现
• FISH尿液检查 – p16 缺失, 是移行上皮细胞肿瘤发生的早期事件和关键 步骤 – 3, 7, 17 染色体的不稳定性与移行上皮细胞肿瘤的浸润 行为有关 – 灵敏度( 大约 80%), 特异性 ( 大约 96%)
CIN2 and CIN3区分正常, ASCUS, and CIN1的灵敏度和特异性达到90% 预测从 CIN1/CIN2 发展到CIN3的风险 在 52%-96%，其预测灵敏度是100% ， 特异性是 70%
可供FISH分析的宫颈细胞样本
宫颈细胞涂片
传统宫颈刮片巴氏涂片
宫颈细胞TCT制片 TCT采集宫颈细胞
标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或未分 化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测
FISH在白血病及实体瘤 中的应用
（1）诊断
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率 在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。据 世界范围统计，每年估计有46.6 万左右的宫颈癌 新发病例，其中80%的病例发生在发展中国家。近 几年来，据一些国家和地区报道，宫颈癌的发病 和死亡大致稳定，但局部有增长的趋势，特别是 宫颈癌的年轻病例增加，宫颈腺癌的发病也趋于 年轻化。在我国部分地区近年也出现了宫颈癌病 人年纪年轻化趋势的报道
新生儿染色体异常发生率
异常类型
37799名男性新生儿中性染色体异常 总数 47，XXY 47，XXY 其他 19173名女性新生儿中性染色体异常 总数 45，X 47，XXX 其他 56952名新生儿常染色体数量异常 总数 21三体 18三体 13三体 三倍体 56952名新生儿常染色体结构异常 （常染色体和性染色体） 总数 平衡性易位 Robertsontan 易位 其他 不平衡性易位 所有染色体异常（常染色体和性染色体） 51 59 34 353 1/1120 1/965 1/1675 1/160（活产） 144 1/395（活产） 82 71 7 3 1 1/695（活产） 1/800 1/8140 1/19000 1/57000 29 2 20 7 1/660（女性） 1/9600 1/960 1/2740 98 35 35 28 1/385（男性） 1/1080 1/1080 1/1350
肿瘤的分子生物学基础
• 1、癌基因 • 2、抑癌基因
基因功能与肿瘤
肿瘤中常见的癌基因种类
肿瘤中常见的癌基因扩增
常见的抑癌基因
白血病及淋巴瘤中常见的基因改变
基因组大小和分辨率
基因数量 人类基因组 ~40,000 片断大小 （kb） 3,000,000 片断大小 （Mb） 3,000
染色体
中期染色体条带 (500 个)
2,000
80
150,000
6,000
150
6
前中期染色体条带 (1,000个)
40
3,000
来自百度文库
3
荧光原位杂交（FISH） 分辨率
1
1-10
PCR/Southern blot
1
<1
分子细胞遗传学
荧光原位杂交技术 (FISH)
多色 FISH (SKY 和 M—FISH） 比较基因组杂交 (CGH） 基因微阵列 (aCGH)
意 义
为什么开展细胞遗传学分析 ?
(A)产前及产后遗传病
染色体异常的发生机率
• 出生婴儿 – 先天性智力障碍（MR）患者 – 先天性心脏病 • SAB 夫妇 • 死胎和 围产期死亡胎儿 • 自然流产 (前三个月) 0.6% 23% 13% 5% 6.0% 60%
染色体异常在自发性流产中的发生率
Turner 综合症
• 1个x染色体的全部或者部 分丢失 ，只发生在女性。 • 是最常见的染色体异常导 致的疾病 ( 活产女性新生 儿发病率大约为 1 / 2500 ) • 身材矮小、卵巢不发育、 性幼稚、 蹼颈、 肾脏和 甲状腺有问题, 骨骼畸形 等 • 生长激素治疗, 雌激素替 代治疗等
(B)白血病及实体瘤
类型 非整倍体 45，X 常染色体单体 常染色体三体 总发生率 16号染色体三体 18号染色体三体 20号染色体三体 21号染色体三体 52 16 3 5 5 20 <1 发生率（%）
其他
三倍体 四倍体 染色体重排
23
26 6 4
唐式综合症在活产中的发生率及与孕妇年龄的关系
发生率
孕妇年龄（岁） 15-19 20-24 25-29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45以上 胎儿出生时 1/1250 1/1400 1/1100 1/900 1/900 1/750 1/650 1/500 1/350 1/275 1/225 1/175 1/140 1/100 1/85 1/65 1/50 1/40 1/25 羊膜穿刺检查 —— —— —— —— —— —— 1/420 1/325 1/250 1/200 1/150 1/120 1/100 1/75 1/65 1/45 1/35 1/30 1/20 绒毛膜活检 —— —— —— —— —— —— —— —— 1/240 1/175 1/130 1/100 1/75 1/60 1/40 1/30 1/25 1/20 1/10
telomere subtelomere whole chromosome paint
locus specific
FISH技术的特点
操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合， 可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析 方法敏感，能迅速得到结果，24小时就可以完成检测 人员培训较快
细胞遗传学技术的步骤
细胞遗传学技术的步骤
细胞遗传技术的步骤
有丝分裂—中期的核型分析
染色体组核型分析
• G-带 (Giemsa) – 富含AT的区域颜色较深 – 优点 • 能看到整个基因组 • 显示每一单个染色体 – 缺点 • 分辨率(5-10Mb) • 进行细胞培养 • 其他会用到的核型分析技术 – R, Q, C, 和 NOR 带
美国，每年5O～75岁无症状的男性进行直肠指 诊(DRE)、PSA检查
当 PSA>10ng/ml时 患癌的几率在50%以上 当PSA为 4～10ng/ml，考虑穿刺活检进一步证实，仅 能发现20～40%的 PCa患者,漏诊率高 当PSA<4ng/ml，不主张做穿刺活检，但近年来发现当 PSA为2～4ng/ml时，20～30% 的患者也发现有PCa PSA作为PCa血清学标记不能有效地区分早期PCa和前 列腺增生，特异性低，特别是当 PSA为2～10ng/ml 时， 有必要研究新的早期PCa诊断方法，有效地筛查出 PSA在2～10ng/ml范围内的PCa
• 肾癌/肾盂癌鉴别诊断, 血尿鉴别诊断(移行上皮细 胞肿瘤早期诊断) 和移行上皮细胞肿瘤治疗后病 程监测的有效手段
前列腺癌(Pca)
一种老年男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤
发病率
发达国家高于发展中国家 欧美：前列腺癌居男性恶性肿瘤的第二位，死亡率 仅次于肺癌 我国：发病率呈上升趋势，已高居泌尿系肿瘤的第 三位，并且发病年龄也日趋年轻化，临床上已经将 其作为老年男性常见恶性肿瘤之一
三种检测方法比较
方法
形态学检测
特异性（％） 敏感性（％）
90 55-80
HPV检测
64－95
84-100
FISH
90
90
• TERC（人类染色体末端酶 ）基因定位在3q26.3 ，该基因的扩增可阻 止细胞凋亡，导致肿瘤产生 • 宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号 染色体长臂扩增。其中，涉及到的最重要的基因可能是TERC基因。该 基因扩增能准确区分宫颈细胞高度癌前病变与低度癌前发育异常，鉴 别诊断的敏感性及特异性均在90%以上；同时，这一扩增也能预测52% －96%的癌前病变有恶变的可能 • hTERC基因扩增的检测极有助于宫颈癌的筛查及早期诊断 • 检测这一基因扩增的标准方法即为FISH技术
临床表现变化多样，其自然发展规律无法预测 晚期可侵及尿道或膀胱颈，引起梗阻症状或刺激症状， 如尿频、尿急、尿线变细等、血尿亦较常见
PCa早期难以察觉, 患者很少引起症状，细胞病理学 改变不典型，诊断易受病理检查者主观的影响
早期诊断成为治疗和判断预后的关键
PCa临床诊断方法
直肠指诊（DRE） PSA抗原筛查 经直肠超声引导穿刺活检
No lesion seen Repeat Pap at 6, 12 months, or HPV testing at 12 months
Cervical pre-cancer or cancer
Treat
• 传统巴氏细胞学涂片&液基薄层细胞检测(TCT） • HPV病毒检测 • 荧光原位杂交（FISH）检测
荧光原位杂交技术(FISH)
荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization，FISH） 生命科学中的“钓鱼” 技术
基本原理：应用荧光染料标记探针DNA，变性成 单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交， 在荧光显微镜下观察并记录结果。
着色探针 着丝粒探针 位点探针
分子细胞遗传学新进展
传统的细胞遗传学
细胞遗传学主要研究染色体的 亚显微结构和基因活动的关系
细胞周期的阶段
简 介
• 60年代早期
• 局限于计算染色体的数目 • 粗略的将染色体按照大小和着丝粒位置进行区分 ( groups A to G)
• 1970年
• 显带技术的建立 • 清楚的分辨出46条染色体
染色体异常 数目改变
• 三倍体 和 四倍体 • 非整倍体
– +21, +18, +13, XO, XXY, 等
染色体异常 结构异常
• 平衡改变 – 易位和 倒位 • 不平衡改变 – 缺失, 扩增, 环状染色体, 和等臂染
色体
倒位
扩增和环形染色体
染色体缺失
• 缺失 – 看得见的 – 识别起来相对容易 • 微缺失 – 看不见 – 识别起来不是很容易
正常 ASCUS
CIN1 CIN2 CIN3
PapI，PapII PapIIw，PapIII
PapIIID
PapIVa，PapIVb PapV
肿瘤
肿瘤
鳞状细胞癌为主，约占95％；腺癌仅为5％左右； 腺鳞癌少见，但恶性度最高，预后最差。
传统的宫颈癌检查及诊断程序
Cervical Pap screening
数量
发生率
唐氏综合症
• • •
21号染色体三体, 95-97% 多余的染色体来自母亲, 唐氏综合症与母亲的年龄有关系, 确切的病因不 是很了解. 活产新生儿发病率为1 /800 to 1 /1,100 , 唐氏综合症与文化、种族、社会阶层以及地理区域都没有 必然的联系。 智能较正常儿童低，认知困难，发育迟缓。他们也有很特殊的面貌，通常双眼距离较远、眼睛向上 斜、鼻梁骨平坦，嘴、牙齿及耳朵均细小。肌张力低。
Normal Repeat Pap 4 to 6 months
ASC-US HPV Testing HPV positive (high-risk type)
ASC-H
LSIL
HSIL
or
HPV negative (high-risk type)
Colposcopy Repeat Pap 12 months
• 行为危险因素 性生活过早、多个性伴侣、多孕多产、社会经济 地位低下、营养不良及性混乱等 • 生物学因素 细菌、病毒和衣原体等各种微生物的感染
子宫颈癌
细胞学分级
Bethesda分级
宫颈内膜新生物 （CIN）
Pap 分级I-V（德国使 用）
正常 ASCUS（非典型性鳞状上皮 增生）
LSIL（低级鳞状上皮化生） HSIL （高级鳞状上皮化生）
细胞遗传学的一般步骤
• • • • • • • • • • 细胞培养 使细胞停留在分裂中期 低渗的方法使细胞膨大 固定染色体，保留核酸 将细胞滴到玻片上 用显带染色技术进行染色 在荧光显微镜下分析染色体 数20个中期分裂相进行分析 常规研究方法可区分400-600条带 高分辨率研究方法可区分>650条带
前列腺癌检测新发现
• 80%左右PCa存在TMPRSS2与ETS 家族的融合改变
子宫颈癌检查
膀胱癌
• 细胞学检查
– 灵敏度( 大约 50-60%), 特异性 ( 大约 98%)
• 膀胱镜检查
– 侵入性
• 膀胱肿瘤抗原
– 灵敏度较高, 但特异性比细胞学要低
膀胱癌检测新发现
• FISH尿液检查 – p16 缺失, 是移行上皮细胞肿瘤发生的早期事件和关键 步骤 – 3, 7, 17 染色体的不稳定性与移行上皮细胞肿瘤的浸润 行为有关 – 灵敏度( 大约 80%), 特异性 ( 大约 96%)
CIN2 and CIN3区分正常, ASCUS, and CIN1的灵敏度和特异性达到90% 预测从 CIN1/CIN2 发展到CIN3的风险 在 52%-96%，其预测灵敏度是100% ， 特异性是 70%
可供FISH分析的宫颈细胞样本
宫颈细胞涂片
传统宫颈刮片巴氏涂片
宫颈细胞TCT制片 TCT采集宫颈细胞
标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或未分 化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测
FISH在白血病及实体瘤 中的应用
（1）诊断
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率 在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。据 世界范围统计，每年估计有46.6 万左右的宫颈癌 新发病例，其中80%的病例发生在发展中国家。近 几年来，据一些国家和地区报道，宫颈癌的发病 和死亡大致稳定，但局部有增长的趋势，特别是 宫颈癌的年轻病例增加，宫颈腺癌的发病也趋于 年轻化。在我国部分地区近年也出现了宫颈癌病 人年纪年轻化趋势的报道
新生儿染色体异常发生率
异常类型
37799名男性新生儿中性染色体异常 总数 47，XXY 47，XXY 其他 19173名女性新生儿中性染色体异常 总数 45，X 47，XXX 其他 56952名新生儿常染色体数量异常 总数 21三体 18三体 13三体 三倍体 56952名新生儿常染色体结构异常 （常染色体和性染色体） 总数 平衡性易位 Robertsontan 易位 其他 不平衡性易位 所有染色体异常（常染色体和性染色体） 51 59 34 353 1/1120 1/965 1/1675 1/160（活产） 144 1/395（活产） 82 71 7 3 1 1/695（活产） 1/800 1/8140 1/19000 1/57000 29 2 20 7 1/660（女性） 1/9600 1/960 1/2740 98 35 35 28 1/385（男性） 1/1080 1/1080 1/1350
肿瘤的分子生物学基础
• 1、癌基因 • 2、抑癌基因
基因功能与肿瘤
肿瘤中常见的癌基因种类
肿瘤中常见的癌基因扩增
常见的抑癌基因
白血病及淋巴瘤中常见的基因改变
基因组大小和分辨率
基因数量 人类基因组 ~40,000 片断大小 （kb） 3,000,000 片断大小 （Mb） 3,000
染色体
中期染色体条带 (500 个)
2,000
80
150,000
6,000
150
6
前中期染色体条带 (1,000个)
40
3,000
来自百度文库
3
荧光原位杂交（FISH） 分辨率
1
1-10
PCR/Southern blot
1
<1
分子细胞遗传学
荧光原位杂交技术 (FISH)
多色 FISH (SKY 和 M—FISH） 比较基因组杂交 (CGH） 基因微阵列 (aCGH)
意 义
为什么开展细胞遗传学分析 ?
(A)产前及产后遗传病
染色体异常的发生机率
• 出生婴儿 – 先天性智力障碍（MR）患者 – 先天性心脏病 • SAB 夫妇 • 死胎和 围产期死亡胎儿 • 自然流产 (前三个月) 0.6% 23% 13% 5% 6.0% 60%
染色体异常在自发性流产中的发生率
Turner 综合症
• 1个x染色体的全部或者部 分丢失 ，只发生在女性。 • 是最常见的染色体异常导 致的疾病 ( 活产女性新生 儿发病率大约为 1 / 2500 ) • 身材矮小、卵巢不发育、 性幼稚、 蹼颈、 肾脏和 甲状腺有问题, 骨骼畸形 等 • 生长激素治疗, 雌激素替 代治疗等
(B)白血病及实体瘤
类型 非整倍体 45，X 常染色体单体 常染色体三体 总发生率 16号染色体三体 18号染色体三体 20号染色体三体 21号染色体三体 52 16 3 5 5 20 <1 发生率（%）
其他
三倍体 四倍体 染色体重排
23
26 6 4
唐式综合症在活产中的发生率及与孕妇年龄的关系
发生率
孕妇年龄（岁） 15-19 20-24 25-29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45以上 胎儿出生时 1/1250 1/1400 1/1100 1/900 1/900 1/750 1/650 1/500 1/350 1/275 1/225 1/175 1/140 1/100 1/85 1/65 1/50 1/40 1/25 羊膜穿刺检查 —— —— —— —— —— —— 1/420 1/325 1/250 1/200 1/150 1/120 1/100 1/75 1/65 1/45 1/35 1/30 1/20 绒毛膜活检 —— —— —— —— —— —— —— —— 1/240 1/175 1/130 1/100 1/75 1/60 1/40 1/30 1/25 1/20 1/10