鸭瘟病毒(DPV)核酸检测试剂盒使用说明

鸭瘟病毒(DPV)核酸检测试剂盒使用说明
Diagnostic Kit for Duck Plague Virus DNA
货号：D6081
规格：48份/盒
保存：-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于5次，有效期12个月。

产品内容：
名称规格
核酸提取液 1.5ml×2管
DPV反应液 1.05mL×1管
DPV阳性质控品50μl×1管
阴性质控品250μl×1管
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

产品说明：
鸭瘟病毒(DPV)核酸检测试剂盒适用于检测从病鸭血液、口腔伪膜及溃疡处粘液、肝、脾、肾等组织样品等标本中分离出的鸭瘟病毒DNA，用于鸭瘟病毒的辅助诊断，其检测结果仅供临床参考。

鸭瘟病毒(DPV)核酸检测试剂盒用一对鸭瘟病毒特异性引物，对鸭瘟病毒DNA进行体外扩增检测，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

所需仪器：PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像仪等
标本采集：在发病早期，无菌采集病鸭血液或刮取口腔伪膜及溃疡处粘液；在动物死亡后，无菌采集肝、脾、肾等组织样品。

保存和运输：上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

使用方法：
1.样品处理（样本处理区）
1.1样本前处理
组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.05g 于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100uL于1.5mL灭菌离心管中；粘液直接取100uL提取。

1.2DNA提取
对上述处理好的标本加入等体积核酸提取液（固体标本加入50uL核酸提取液），100℃恒温处理10分钟，13,000rpm离心5分钟，取上清液转移至新的1.5mlEP管，-20℃保存。

2.试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性
对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂DPV反应液
用量（样本数为N）21μl
3.加样（样本处理区）
将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取4μl，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR扩增（核酸扩增区）
4.1将待检测反应管置于PCR仪反应槽内；
4.2推荐循环参数设置：
步骤循环数温度时间11cycle94℃2min
235cycle 94℃30sec 58℃30sec 72℃30sec
反应体系为25ul；
5.电泳检测
1)2%琼脂糖凝胶配制：秲释50倍TAE缓冲液至1倍(取20ml50倍TAE，加980ml双蒸水至1L)，称4g琼脂糖放于500mL锥形瓶中，1倍TAE缓冲液200ml,置入微波炉中加热熔解(避免加热沸腾溶液外溢)，再加入10μl染料充分混匀。

在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后使用。

2)电泳：用移液器取PCR扩增产物10μl于琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压，1倍TAE缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。

6.结果判定
阳性质控品出现446bp条带，阴性质控品不出现条带或出现片段较小的引物二聚体条带，实验结果成立。

被检样品出现446bp条带，判断为阳性，否则为阴性。

注意事项：
所有操作严格按照说明书进行；
试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
反应液应避光保存；
反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。