一个水稻不育突变体基因的初步定位

一个水稻不育突变体基因的初步定位

发表时间：2018-06-22T14:45:55.647Z 来源：《知识-力量》2018年6月上作者：金永浩[导读] G537是从籼稻品种中恢8015经γ射线辐照诱变后代群体中获得的一个雄性不育突变体。本论文以该突变体及其野生型品种中恢8015为材料，比较分析了该突变体的性状表型特征和花粉育性；以该突变体与广亲和粳稻品种02428杂交配置G537/02428 F2群体，运用 SSR、InDel等分子标记进行基因定位[1]。（长春科技学院，吉林长春 130600）

摘要：G537是从籼稻品种中恢8015经γ射线辐照诱变后代群体中获得的一个雄性不育突变体。本论文以该突变体及其野生型品种中恢8015为材料，比较分析了该突变体的性状表型特征和花粉育性；以该突变体与广亲和粳稻品种02428杂交配置G537/02428 F2群体，运用 SSR、InDel等分子标记进行基因定位[1]。结果表明突变体与野生型表型相比表现出株高降低，突变体的穗颈包颈，且穗长加长，叶子色彩加深，还有结实率下降的现象。突变体的花药较为瘦小、没有开裂的现象，从外表上看是黄白色，花药中的花粉不能正常发育，这种不育要属于普通雄性不育型。这个基金在3号染色体的RM3646与RM3204中间，其间距为7Mb。关键词：水稻；籼稻；雄性不育；突变体；基因定位 1 材料与方法

1.1 试验材料

从籼稻品种中恢8015经过Co60γ射线辐照诱变M1 代群体中获得的一个雄性半不育突变体G537，经过连续多代自交后获得的稳定雄性半不育突变体G537；但是某些野生品种中恢8015；而后以G537为父本，使其与广亲以及粳稻品种02428进行配置杂交组合，从而衍生得到F2定位群体。

1.2 试验方法

1.2.1 材料的种植

本实验在2016年12月-2017年4月和2017年5月 -9月分别于海南陵水县的水稻试验田和杭州的中国水稻试验田来进行了实验。第一代在11月23号进行种植，在12月20日进行移栽。第二代在杭州种植，5月20日开始种植，于6月15日进行移栽，在移栽之后每行都种了12颗植株，这些植株的肥水管理和一般大田一样。F1种植306株，在种子收获后，再进行播种，得到第二代单株个体。并观察第二代的突变体G357以及中恢8015在外观和性状上的差异。2.2.2 突变体的表型与花粉育性观察取同一时期G537突变体和野生型中恢8015，比较测定突变体与野生型中恢8015的株高、穗颈包颈情况、穗子长短、叶色深浅、颖壳颜色、结实率。

在水稻花药成熟即将开花时，分别从野生型中恢的8015与突变体G537的单株上取穗上的部位相同的花，随后将其置入配好的乙醇和冰乙酸的混合液中，将其置于4°C的环境下保存。在镜检时一般使用I2-KI溶液来进行染色。在染色之后用显微镜来观察，观察花粉的形态和颜色的变化，从而得到可育的划分，和败育的原因和类型。从外观上看，染色深或是染色不彻底的为可育的单株。与其相对应的染色浅或者是染色形状较为不规则的是败育的单株。整个实验过程中，花粉粒总数应该足够大，在其中取平均值则能代表了单株的花粉特性。

1.2.3 DNA的提取

将试验材料于插秧后20天，取单株主茎叶片，采用改良的CTAB法 (Mμrray andThompson,1980)快速提取水稻总DNA，具体提取方法如下：

(1)称量0.1g嫩叶并将其置入2ml离心管中，而后加入2×CTAB的缓冲液900μL，再用无菌棒搅拌叶片，快速捣碎；

(2)将离心管中的液体在65℃的环境下进行水浴30min后取出，而后滴入体积相同的氯仿或是异戊醇的混合液，将混合液搅拌，混匀约10分钟；

(3)完成上述操作后，放到-4℃的环境下进行离心处理，在8000-12000rpm离心操作10min；

(4)取实验中的上清液移动至另一个1.5ml 新的离心管内，加入同样体积的且经过处理的异丙醇，而后将离心管轻柔混匀约5min；

(5)在-4℃的环境下离心，10000rpm离心操作10min；

(6)之后将液体倒入废弃池中，先用70％浓度的乙醇清洗一遍，再用95％浓度的乙醇再次清洗；

(7)等到风干后，加入已灭菌的1×TE溶液对液体进行稀释，

(8)置于-20℃的环境下中保存备用。

1.2.4 分子标记的选择和开发

分子标记的选择与开发：根据相关网站以及分子技术的网站提供的水稻的基因序列，并将其与籼稻进行基因序列的信息比较，进而找出串联或是重复，或是大部分相似的序列。之后用Primer来设计引物。而后用引物来检测两个杂交的父本，从而可以有效的筛选出引物来发掘群体中的隐性的单株。

1.2.5 引物筛选与PCR扩增及PCR产物检测 573条的反应引物是由网站上提供的序列，而后委托北京奥克鼎盛公司合成，使得这些引物分布在12条水稻染色体的两端，在这些染色体上来对引物进行甄别。

(1)关于PCR技术，它的基本反应应该在S1000型PCR仪上全程操作，在PCR反应体系中包含：模板DNA、10×PCR bμffer 1μl、Primer(20μM) 0.05μl、和dNTP 0.8μl (北京TIANGEN生物公司)、Taq酶：0.15μl，ddH2O 6μl 。

(2)PCR的反应过程应该是：首先咋94°C的高温下来进行预变性处理，约为5分子，之后在同样的环境下进行正式变性，持续30秒，而后在退火30秒，等温度降低到72°C时再延伸30秒，最后延伸7分钟。

扩增的产物用6％聚丙烯酰胺凝胶处理，使用 6μl与1μl的样品缓冲液来做混合处理并搅拌均匀，其中电泳缓冲液为1×TBE,120V恒压电泳1.5h，经0.05%的AgNO3溶液染色15分钟、显色后进行特异性检测。

1.2.6 基因的初步定位

采用卢杨江的简易DNA提取法单株来提取G537父本的第二代突变型的个体，以及整个基因组的DNA序列。可以采取原始的图位克隆的办法，对基因序列中的InDel分子来进行标识来检查突变体G537的特性与02428粳稻间的多态程度。其中有146对拥有多态性的引物平均分布在12条染色体的两边，者可以对突变了的单株进行识别和简单的定位。而PCR的扩增技术则是采用北京鼎国昌盛生物技术有限公司的技术。在PCR反应体系的参照说明书中明确指出了PCR的反应条件，在保持温度相对恒定，保持五分钟，而后迅速的作正式变性30秒。把温度控制到55°C下30秒，再升到72°C延伸30秒，将这个过程重复30次。在整个过程结束后，将PCR扩增后的产物在聚丙烯酰胺的凝胶中进行电泳，电泳完成狗用硝酸银溶液染色，并使用甲醛或是氢氧化钠来显色，借此来判断第二代个体的基因型[10]。结论突变体G537是一个表现为雄性不育的突变体，突变体G537与野生型8015相比育性明显下降，还表现为株高降低了一些，穗颈包颈，穗长变短，叶片的颜色加深，颖壳出现褐色。通过镜检来对花粉进行监测，进而可观察到突变体花药的状态，体积较为小、干瘪、没有出现开裂，从外表看呈黄白色，花粉典败。通过对突变体G537基因进行遗传分析，表明其受隐性单核基因的控制，利用Indel引物来通过10个单株将G537的不育基因成功定位在物理距离为7Mb的标记的RM3204与RM3646之间。

在水稻的杂交利用时，雄性的不育是一条尤为重要的途径，但是现阶段，对于雄性细胞核不育的产生因素的研究仍然处于萌芽阶段，不过可以确定的是，败育的主要原因四雄性配子未能正常发育。在花粉的发育过程中，从一开始，就有大量的无关基因参与了花药的构成和组建，在孕育繁殖的过程中，不管哪个基因出现了问题，不能正常表达，都有可能导致雄性不育。本研究发现的突变体G537表现为稳定的雄性不育，可以为以后隐性细胞核雄性不育的研究提供材料和方向，还可以为雄性的不育突变体产生的机理提供理论依据。参考文献

[1]李园园. 水稻雄性不育突变体的细胞学研究及遗传分析[D].四川农业大学,2008.

[2]孙小秋,肖云华,邓晓建,等.水稻雄性不育突变体802A的遗传分析及基因定位[J].中国农业科学,2011,44(13):2633-2640.

[3]秦延春. 新型分子标记技术与水稻雄性不育遗传标记研究[D].广西大学,2008.