海藻酸羧甲基壳聚糖／聚乙烯醇水凝胶的制备及对蛋白药物释放的探讨

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Ｌｉｕ Ｑｕａｎ１ ， Ｚｕｏ Ｑｉｎｈｕａ１ ，Ｈｅ Ｌｉｕｍｉｎ１ ，Ｈｕａｎｇ Ｙｕｅｘｉｎ２ ， Ｘｕｅ Ｗｅｉ１ （ １． æ ∑ˇ∑ ∳∭ ˇ ∑ ∳∯ ‟ ˋ ∰ ∰ ∳ ∑✕ ˋ ˇ ∳∰ ∰ ‟ ˇ ∳ ˇ ˋ ˇ ‟， ’ ∑ ˇ ∭∰ ˇ ∳∭ ∳ ∯✕ ∰∳ ∰∑ ∳ ∰ ， æ ， ， ； ， ， ） ∳ ∰∰ ∰ ∳ ˊ∑ ‟ ∳ ˇ ˋ ∰ ɶ ˋ ５１０６３２ ∳ ∰ ２ ． ˋ ∰ ∰ ∳ ∰ ɶ Ω ∳ ∳ ∰ ． ˇ ． ˋ ∰ ɶ ˋ ５１０６３２ ∳ ∰ æ ： ≏‟ ˇ ∑ˇ Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ （ ＢＳＡ）ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｄｒｕｇ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｌｏａｄｉｎｇ ａｌｇｉｎａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ （ ／ （ ＣＭＣＳ） ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ） ＰＶＡ）ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ． Ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ａｌｇｉｎａｔｅ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ， ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ ｉｎ ｈｙｄｒｏ ｐｏｌｙ（ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ，ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｅｒｃｅｎｔ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｓｗｅｌｌｉｎｇ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｇｅｌ ｍａｔｒｉｘ， ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｄｅｔａｉｌ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｄｒｕｇ （ Ｒ ）ｗａｓ ３２％ ｗｈｅｎ ｐＨ ｗａｓ １． ２ ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐＨ ｖａｌｕｅ．Ｔｈｅ Ｒ ｗａｓ ５３％ ｗｈｅｎ ｐＨ ｗａｓ ６． ８ ，ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ ７０％ ａｔ ｐＨ ８． ０． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｐＨ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ． ：ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ；ａｌｇｉｎａｔｅ；ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ；ｐｏｌｙ（ ；ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ） æ˙∑‟
第 ９ 卷 第 ２ 期 ２０１４ 年 ２ 月
中国科技论文 ＣＨＩＮＡ ＳＣＩＥＮＣＥＰＡＰＥＲ
Ｖｏｌ． ９ Ｎｏ． ２ Ｆｅｂ．２０１４
海藻酸 羧甲基壳聚糖 ／ 聚乙烯醇水凝胶的制备及 对蛋白药物释放的探讨
刘 权１ ，左琴华１ ，何留民１ ，黄跃新２ ， 薛 百度文库 巍１
（ 暨南大学生物医学工程研究所， 广州 ５１０６３２ ； １．暨南大学广东高校生物材料重点实验室， 广东健泽医药有限公司 ， 广州 ） ２． ５１０６２０ 摘 要： 以牛血清白蛋白（ 为模型药物， 制备了海藻酸 羧甲基壳聚糖（ ／ 聚乙烯醇 （ 复合水凝胶， 考察了海藻酸 ＢＳＡ） ＣＭＣＳ） ＰＶＡ） 分析了复合水凝胶基质的结构、 溶解分数以及水凝胶在不同 ｐＨ 值下的溶 水凝胶微球的粒径和微球在水凝胶基质中的分散性， 药物的累积释放率（ Ｒ ） 随 ｐＨ 值的升高而升高， 当 ｐＨ 值为 １． 当 ｐＨ 值为 ６． 胀率和药物释放。结果表明， ２ 时 Ｒ 为 ３２％， ８时 当 ｐＨ 值为 ８． 表明该复合水凝胶的释药性能受 ｐＨ 值的影响较大。 ０ 时 Ｒ 达到 ７０％， Ｒ 为 ５３％ ， 关键词： 水凝胶； 海藻酸； 羧甲基壳聚糖； 聚乙烯醇； 药物释放 中图分类号： 文章编号： Ｏ６３１ 文献标志码： Ａ ２０９５ ２７８３ （ ２０１４ ） ０２ ０２５６ ０５
４ ５］ 等方面［ 。羧甲基壳聚糖（ 是一种水溶性的 ＣＭＣＳ） 壳聚糖衍生物， 由于它的物理、 化学和生物特性， 已 经被广泛地应用到生物医学领域， 例如， 伤口敷料、 ６ ８］ 人工骨头和皮肤和抗菌剂［ 。 然而， 由这些材料组 成的纳米凝胶、 微凝胶和水凝胶支架都很难独立地 对药物进行控制释放。 控制释 放 的 给 药 系 统 在 生 物 医 药 中 越 来 越 重 要， 如以一些药片、 凝胶等形式进行释放。 通过研究 蛋白质和多肽给药系统发现， 蛋白质和多肽在人体 内难以被降解， 并且能够控制组织中细胞激素的再 ９ １０ ］ 生［ 。水凝胶具有良好的载药性能， 以水凝胶微球 和水凝胶基质形成的复合水凝胶能够进行局部或靶 向给药， 这些给药系统具备了一定的控释功能。Ｚｈｕ １１ ］ 等［ 将海藻酸凝胶和 ＣＭＣＳ 凝胶复合， 降低了药物 ［ １２ ］ 释放速 率。 Ｌｉｕ 等 将 海 藻 酸 凝 胶 和 胶 原 凝 胶 复 合， 使得 ＢＳＡ 在释放的 １１ ｄ 内有明显的缓释效果。
已经被广泛 水凝胶由于其高含水量和亲和力， 地使用到生物材料和生物技术领域， 如药物释放、 组 １］ 织工程和人工器官［ 。 海藻酸钠是一种从褐藻提取 的天然多糖， 遇到二价阳离子 （ 如 Ｃａ２＋ ） 能迅速结合 形成凝胶。 这种离子化凝胶具有优良的网格结构， 同时保持了良好的弹性。 海藻酸由于具有良好的生 物相容性、 温和的凝胶条件和低免疫原性， 被广泛地 ２ ３］ 运用到食品和药厂用作固化和包封基质［ 。 在药 物包载过程中， 海藻酸水凝胶的制备方法备受关注。 由于制备过程不涉及到超声和有机溶剂的使用， 因 此最大限度地降低了制备过程直接对蛋白药物结构 造成的破坏。聚乙烯醇（ 能够通过化学和物理 ＰＶＡ） 交联 形 成 水 凝 胶。 采 用 反 复 冷 冻 解冻法制备的 水凝胶具有无毒 、 性质稳定 、 优良的力学性能 ＰＶＡ 和亲水性而广泛用于人工软骨材料、 药物载体、 眼科 材料、 人工细胞微囊化、 抗凝血材料和生物医用海绵
第 ２ 期
［ ］
刘 权， 等： 海藻酸 羧甲基壳聚糖 ／ 聚乙烯醇水凝胶的制备及对蛋白药物释放的探讨
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羟基乙酸微球和 ＰＶＡ 水凝胶 Ｓｈｅｎ 等 １３ 将聚乳酸 复合， 研究不同温度响应下的释放曲线。 本文选择了海藻酸、 ＣＭＣＳ 和 ＰＶＡ 制备复合水 凝胶， 用来控制蛋白质或多肽药物的释放。 这个复 并且延长药物 合体系能够有效地避免药物的突释， 的释放时间。药物首先通过高压静电液滴法直接包 封到海藻酸微球中， 在此之后， 将载药微球均匀分散 到 ＣＭＣＳ ／ 冷冻—解冻 ３ 次形成复 ＰＶＡ 基质溶液中， 合水凝胶。选择 ＢＳＡ 作为模型药物， 研究了微球和 水凝胶基质间的相互作用以及载药复合水凝胶在不 同 ｐ Ｈ 值响应下的溶胀率和释放量。
表 １ 复合水凝胶的组成 Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ
组分 （ ＣＭＣＳ） ʒ （ ＰＶＡ） Ⅰ ０ʒ６ Ⅱ ２ʒ４ Ⅲ ３ʒ３ Ⅳ ４ʒ２
软件随机测量 １００ 个微球直径并计算平均粒径， 绘 制粒径分布图。 １． ３． ２ 微球在水凝胶基质中的分散性 将黑色墨水滴加到海藻酸钠溶液中， 用以制备 将染色微球复合到基质溶 墨水染色的海藻酸微球， 液中循环冷冻解冻形成水凝胶。 将制得的海藻酸微 球 ／ ＣＭＣＳ ＰＶＡ 复 合 水 凝 胶 置 于 体 视 显 微 镜 下 观察。 １． ３． ３ 水凝胶内部结构的表征 将复合水凝胶制备好后在 －２０ ħ 放置过夜， 迅 速置于冷冻干燥机内冻干至恒重， 将所有待测样品 置于铜台上， 预先喷金处理， 扫描电镜观察其表面形 貌及内部结构。 １． ４ 溶解分数 准确称取一定量的复合水凝胶， 浸入去离子水 中（ 室温 ２５ ħ） 。 溶 胀 平 衡 后， 用滤纸吸干表面水 准确称量复合水凝胶的质量。 根据以下公式计 分， 算溶解分数： 复合水凝胶胀后的质量 溶解分数＝ 。 复合水凝胶溶胀前的质量 ˑ１００％ １． ５ ’ 值对溶胀性能的影响 准确称取一定量的复合水凝胶 （ 选取体积比为 和 复合水凝胶 ） ， 然后分别浸入盐酸 、 磷酸 ０ʒ６ ２ ʒ４ 磷酸二氢钾和磷酸氢二钾配制的缓冲溶液 二氢钾、 中（ 室温 ２５ ħ） ， ２、 ６． ８ 和 ８． ０ 。溶胀 ｐ Ｈ 值分别为 １ ． 平衡后， 用滤纸吸干表面水分， 准确称取湿凝胶的质 量， 考察不同 ｐ Ｈ 值的缓冲液对溶胀率的影响。通过 以下公式计算溶胀率： 溶 胀 率 ＝ 复合凝胶溶胀后的质量－复合凝胶溶胀前的质量 复合凝胶溶胀前的质量 ˑ１００％。 １． ６ 药物的包封及 ’ 值对药物释放的影响 １． ６． １ ＢＳＡ 标准曲线的测定 将 ＢＣＡ 试剂盒内的标准 ＢＳＡ 质量浓度 （ ２ ０００ ／ ） 分别稀释成 、 、 、 、 、 ｍＬ １ ５００ １ ０００ ７５０ ５００ ２５０ １２５ 、 ｇ μ ／ （ ） 的标准溶液 。 配制好试剂盒 ２５ 和 ０ μ ｍＬ Ｂｌａｎｋ ｇ 中的工作试剂， 加入 ２５ μ Ｌ 的标准样品和 ２００ μ Ｌ工 作试剂， ３７ ħ下孵育 ２ ｈ。 采用酶标仪在 ５７０ ｎｍ 测 得吸光度， 以标准 ＢＳＡ 的浓度为横坐标， 吸光度值为 纵坐标， 绘制标准曲线。 １． ６． ２ 药物的包封及释放 将海藻酸微球用纯水清洗 ３ 次后， 收集滤去微 球后氯化钙残留液和水洗后的残留液， 采用 ＢＣＡ 试 剂盒测定残留液中 ＢＳＡ 的质量浓度。根据以下公式 计算海藻酸微球中 ＢＳＡ 的包封率： 海藻酸微球中 ＢＳＡ 质量浓度 包封率＝ ˑ１００％。 ＢＳＡ 初始质量浓度 将新制备的复合水凝胶（ 选取体积比 ２ ４ 的复 合水凝胶） 样品置于 ５０ ｍＬ 三角锥形瓶中， 分别加入
１ 实验部分
１． １ 实验材料与仪器 海藻酸钠（ ２５ ħ时 ２％水溶液的黏度为 ２５０ ｍＰａ· ， 醇解度： ， 阿 ｓ） Ｓｉｇｍａ 公司； ＰＶＡ （ ９９． ８％ ～ １００％） 拉丁公司； （ 脱乙酰度 ， 羧化度 ） ＣＭＣＳ ≥９０％ ≥８０％ ， 广州菲博生物科技有限公司； ＢＳＡ， Ｇｅｎｖｉｅｗ 公司； 试剂盒 ， 美国 ＢＣＡ Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公司。 连续变倍体视显微镜 （ ， 重庆奥特光学 Ｓｍｚ Ｔ４ ） 仪器公司； 扫描电子显微镜（ ） ， 高 ＸＬ ３０ Ｐｈｉｌｉｐｓ 公司； ， 天津三川公司； 微 压直流电源 （ ＤＷ Ｐ５０３ ４ＡＣＣＤ） 量注 射 泵 （ ） ， 保 定 兰 格 公 司 ； 酶 标 仪 ＬＳＰ０１ １Ａ （ ， 美国 Ｂｉｏ 数显气浴恒温振荡器 ＥＬＸ８００ ） Ｔｅｋ 公司； （ ， 江苏金坛公司。 ＨＡ Ｓ） １． ２ 复合水凝胶的制备 采用高压静电液滴法制备海藻酸钙微球， 以含 ／ ／ １０ ｍｇ ｍＬ 的 ＢＳＡ 和 ２０ ｍｇ ｍＬ 的海藻酸钠水溶液 为原料液， ／ 的氯化钙水溶液为接收器 ， 选 ３０ ｍｇ ｍＬ 保持针尖与氯化钙溶液的液面 用针头内径 ２００ μ ｍ， 距为 ２０ ｃｍ， 电场电压为 １０ ｋＶ。 待微球制备完后， 凝胶化时间为 １０ ｍｉｎ， 用去离子水洗 ３ 次。 用滤纸 滤掉微球表面的水分， 称取 １００ ｍｇ 的海藻酸钙微球 分别加入到 ２ 个已均匀混合的水凝胶基质中， 水凝 胶基质中包含了 ２０ ｍｇ ／ 和 ／ ｍＬ ＣＭＣＳ １００ ｍｇ ｍＬ 其 体 积 比 分 别 为 ０ʒ６ 、 ＰＶＡ 溶 液， ２ ʒ ４、 ３ ʒ３ 和 ， 涡旋数秒使其分散均匀 。 将含海藻酸钙微球 ４ʒ２ 的水凝胶置于－２０ ħ中冷冻 ２０ ｈ， 再在 ２５ ħ下解冻 循环冷冻解冻的次数为 ３ 次。 表 １ 为复合凝胶 ４ ｈ， 的组成。
收稿日期：２０１３ １１ １４ 基金项目：广东省教育部产学研结合项目（ ； 广州市科技计划项目（ ； 广州市天河区科技计划项目（ ２００９Ｂ０９０３００１５５ ） １０Ａ３１０２００３９ ） １０ＺＨ０８４ ） 作者简介：刘权（ ， 男， 硕士研究生， 主要研究方向为药物载体生物材料 １９８８ —） 通信联系人： 薛巍， 教授， 主要研究方向为生物材料， ｗｅｉｘｕｅ＿ ｃｏｍ ｊｎｕ＠ｈｏｔｍａｉｌ．