蛋白酶活性测定

华南农业大学

综合实验报告

实验项目名称：酶活力测定

实验项目性质：综合实验

计划学时：

所属课程名称：食品与发酵工业分析

实验完成时间：2013.05.10

糖化酶活力测定（直接滴定法）

1、原理

采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖 (还原糖)，以直接滴定法测定。

2、试剂及仪器

（1）碱性酒石酸铜钾溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取

15.693g硫酸铜(Cu

2SO

4

·5H

2

O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；

乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL

（2） 0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。

（3） pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：

0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；

0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH

3COONa·3H

2

O），用水定容至

1000mL；

pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。

（4） 0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。

（5） 2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。

（6）固体曲

（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶

3、测定步骤

（1） 5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min搅拌一次。用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。

（2）固体曲糖化液的制备：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴预热10min。准确加入5mL 5％固体曲浸出液，摇匀，立即记下时间。于30℃水浴准确保温糖化1小时。迅速加入15mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液，终止酶解反应。冷却至室温，用水定容至刻度。

同时作一空白液：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL 容量瓶中，先加入15mL 0.1mol/L 氢氧化钠溶液，然后准确加入5mL 5％固体曲浸出液，用水定容至刻度。

（3）定糖

空白液测定：吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5mL ，置于150mL 三角瓶中，准确加入5mL 空白液，并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液，使滴定时消耗的0.1%标准葡萄糖溶液在1mL 以内，摇匀。于电炉上加热至沸腾，立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作需在1min 内完成。

糖化液测定：准确吸取5mL 糖化液代替5mL 空白液，其余操作同上。 4 实验现象和数据记录

表1 定糖消耗的标准葡萄糖体积

（其中在做定糖的糖化液预实验时发现用标准葡萄糖溶液滴定糖化液时，没有滴加标准葡萄糖溶液时，糖化液在煮沸时由蓝色变为无色，所以我们小组把糖化液稀释了10倍后再做糖化液的定糖实验）

5 计算与结果

固体曲糖化酶活力定义：1g 绝干固体曲，在30℃、pH4.6、1小时内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。

100015100550)100⨯⨯⨯⨯⨯-=W

c V V （

糖化酶活力

即 mg 2.3411000515100550%1.0107.6-2.9=⨯⨯⨯⨯⨯=）（糖化酶活力 所以，实验测得的糖化酶的活力为341.2mg 。

式中：V 0——5mL 空白液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积（mL ）

V ——5mL 糖化液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积（mL ）

C ——标准葡萄糖溶液浓度（g/mL ）

50/5——5mL糖化液换算成50mL糖化液中的糖量（g）

100/5——5mL浸出液换算成100mL浸出液中的糖量（g）

W——绝干曲称取量（5.0g）

1000——g换算成mg

6 分析与讨论

该实验结果存在着误差，误差的原因：①我们小组的空白液和糖化液都只是做一次实验，而没有做平行实验，改进方法是各做3次平行实验；②因为我们的空白液滴定是用原液，而糖化液是用10倍稀释的，所以也会是结果不那么精确，改进放法：应把空白液也作10被稀释比较好。

蛋白酶活性的测定（福林酚法）

1 原理

蛋白酶在一定的温度pH条件下，水解酪蛋白底物，产生含酚基的氨基酸在碱性条件下，将福林还原，生成钼蓝和钨蓝，在680nm处测吸光度。

2 仪器与试剂

2.1 仪器

紫外分光光度计恒温水浴锅

2.2 试剂

TCA 酪蛋白溶液碳酸钠溶液福林试剂

3 实验步骤

比色管A(空白）：加酶液1ml于大试管中于40o C水浴2min，再加TCA2ml于40o C 水浴10min，加酪蛋白溶液1ml，摇匀，静置10min，过滤取滤液1ml于比色管中，加入碳酸钠溶液5ml，加入福林试剂1ml，于40o C水浴20min，再测吸光度。比色管B: 加酶液1ml于大试管中于40o C水浴2min，加酪蛋白溶液1ml，于40o C 水浴10min，再加TCA2ml，摇匀，静置10min,过滤取滤液1ml，加入碳酸钠溶液5ml，加入福林试剂1ml，于40o C水浴20min，再测吸光度。

4 实验数据记录

4.1 标准曲线的制作

表2 不同浓度酪氨酸对应的OD值测定记录