宏基因组技术及其应用研究进展
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2 宏基因组文库构建
2. 1 载体系统选择 目前, 常用的 克隆载体有质粒载体( 如 pU C18
和 pU C19) , 插入片段一般小于 10 kb; Cosmid( 黏粒 载体, 如 pWE15) 和 F osmid, 插 入片段 30~ 45 kb; BAC( 细菌人工染色体, 如 pBeloBAC11) , 插入片段 大于 100kb。如何选择合适的载体系统, 应考虑以 下因素: 所提 DNA 的质量及研究目的, 包括欲插入 目的片段的大小、所需要的载体拷贝数、使用的宿主 以及筛选方法等。如对腐殖质含量较高或剪切较严
分别 为 0. 001% ~ 0. 1% 、0. 25% 、0. 1% ~ 1% 、 0. 1% ~ 3% 、1% ~ 15% 、0. 25% 和 0. 3% [ 1] 。对 一 些特殊的微生物群落如生物膜( biofilm) , 直到近几 年才稍有了解, 生物膜是一个组成成分复杂、具有三 维结构和信息传递系统的复杂的社会群体[ 324] 。随
期为同类研究提供参考。
[ 关键词] 宏基因组; 宏基因组学; 环境微生物
[ 中图分类号] Q343. 1
[ 文献标识码] A
The Advance s of Meta genome Technology and Its Applications
SONG P ei2yong1 , MA Li2li2 , WAN G Qing2rong1 , LI Dai1 , WEI Zhi2qin1
( 1. Depar tment of Biology , Zunyi Nor ma l College, Zunyi, Guizhou 563002; 2. College of Lif e Science, Sichuan Nor mal Univer sity , Chendu, Sichua n 610066, China)
3 宏基因组文库筛选
3. 1 功能驱动的筛选 功能驱 动的 筛选 ( Funct ion2driven screening)
即基于活性的筛选。是根据重组克隆产生的新活性 而进行筛选的方法。迄今, 利用功能驱动筛选已从 土壤宏基因组文库中分离到的异源基因产物有: in2 dirubin, violacein, dexyvio2lacein, t yr osine deriva2 t ives 和 turbomycins A/ B[ 21222, 31] 。功能驱动筛选的 优点: 只要基因能在宿主中表达, 就可以根据基因表 达特性进行筛选, 能迅速找到可用于工农业和医药 业的酶等蛋白质和抗生素等天然产物, 在工业上有 很多重要的酶就是用这种方法发现的。主要缺点: 目的基因必须能在宿主中进行功能表达, 而基因表 达与否除了和宿主有关外, 还决定于基因本身的完 整性, 这就要求一方面要选择合适的宿主菌株, 另一 方面要求克隆到基因或基因簇的全长, 一旦克隆过 程中基因的某个组件遭到破坏将使基因无法表达, 也就不能根据表型加以筛选。筛选工作量大、效率
体在宿主细胞中的稳定性, 宿主能否为相关功能基 因提供必需的转录表达体系, 对异源表达基因产物
是否有较强的相容性, 以及目标性状( 如抗菌性) 及 缺陷型等因素。目前, 构建宏基因组文库最常用的 宿主是大肠杆菌( Escher ichi a col i ) , 其次, 变铅青链 霉菌( S tr ept omyces l i vid ans) 和 恶臭 假 单 胞杆 菌 ( P seudomonas p ut ida ) 也可以 作为构 建文库 的宿 主[ 1 9220] 。研究表明, 不同微生物种类所产生的活性 物质有明显差异, 不同的研究目标应选择不同的宿 主菌株。鉴于 70% 的抗生素来源于放线菌的事实, 若以寻找抗菌、抗肿瘤活性物质为目标, 选择链霉菌 为宿主较理想; 而筛选新的酶则采用大肠杆菌为宜。 2. 3 转化
贵州农业科学 2009, 37( 10) : 14~ 18 Guizhou Agricultur al Sciences
[ 文章编号] 100123601( 2009) 102067120014205
宏基因组技术及其应用研究进展
宋培勇1, 马莉莉2 , 王庆容1 , 李 黛1 , 魏志琴1
( 1. 遵义师范学院 生物系, 贵州 遵义 563002; 2. 四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610066)
重的 DN A 样品适宜构建质粒文库, 小片段 的文库 适用于筛选新的与代谢相关的单基因或小操纵子。
而对于含较大基因簇或大片段的 DNA 样品则适宜 构建 Cosmid、F osmid 或 BAC 文库, 从而筛 选由较 大基因簇编码的复杂代谢途径或能够表征环境中未
培养微生物基因组的较大基因片段。
2. 2 宿主系统选择 宿主菌株的选择主要考虑其转化效率, 重组载
Abstr act: It is known t hat less t han 1% of microorganisms could be obt ained by t radit ional culture approaches. As a new cult ural2independent idea and method, met agenomics at t empts t o overcome t his bott leneck, a lot of un2culturable microorganisms could be obt ained from t he environment . Significant progresses have been achieved since t he metagenome t echnology been int roduced t en years ago. T his paper reviewed the concept , met hodologies, and applicat ions, et c. of metagenomics.
1. 2 间接提取法 间接提取法是先把微生物细胞从环境样品中分
离出来, 再 从微生 物细胞 提取 DNA 并纯化[ 11213] 。 间接提取法所得的 DNA 纯度较高, 但 DNA 产量及 所包含的基因组信息的广泛性不及原位裂解法[ 14] 。 由于间接提 取法提 得的 DNA 片 段长度 相对较 长 ( 20~ 500kb) , 适合构建黏粒( cosmid) 文库和细菌人 工染色体( BAC) 文库。
1 环境样品 DNA 提取
宏基因组学其上游的关键性技术是环境 DNA
[ 收稿日期] 20092 05221; 2009209211 修回
[ 基金项目] 贵州省科学技术基金资助项目/ 贵州石漠化环境中宏基因组文库的构建0 [ 黔科合 J 字( 2008) 2103] [ 作者简介] 宋培勇( 1966- ) , 男, 硕士, 副教授, 从事微生物资源与开发研究。E2mail: py66 song@ 126. com
境的特殊性和复杂性, 在实验室条件下, 难以模拟和 重现其生活的原始环境条件, 致使环境中仍有高达 99% 的微生物未能得到纯培养, 换言之, 通过现有的 分离培养方法获得的微生物估计仅占环境微生物总 体的 1% 左右[ 122] 。海水、淡水、中营养湖水、未污染 河水、活性污泥、沉积物和土壤中微生物的可培养性
16S rRNA 基 因, 成 为宏基 因组学研 究的里 程碑。 1998 年, H andelsman J 等[ 8] 在前人研究的基础上, 正式提出了宏基因组( met agenone) 的概念, 其定义 为/ The genomes of the total microbiot a found in nature0, 即生境中全部微小生 物遗传物质的总和。 与其同义的术语有/ 元基因组0/ 环境基因组0/ 群落 基因组0和/ 生态基因组0等。因此, 1998 年成为公 认的宏基因组学( metagenomics) 元年。所谓宏基因 组学就是利用非培养的分子生物学技术、方法和手 段对宏基因组进行系统研究, 即分析微生物在环境 中的基因组集合, 研究其 群落结构与生态 功能等。 宏基因组 技术流 程为: 1) 从环 境中提 取宏基 因组 DNA; 2) 用核酸内切酶切割成一定长度的 DNA 片 段并连接到合适的载体上; 3) 转化宿主菌, 形成一个 重组的 DNA 文库即宏基因组文库; 4) 宏基因组文 库筛选。宏基因 组技术采取非 培养方 法, 从 DNA 提取入手构建宏基因组文库, 使从研究环境中获得 大量未能培养的微生物成为现实, 极大的推动了环 境微生物生态学的发展, 为人类开发利用自然环境 中微生物基因资源开辟了新的途径。作者对宏基因 学的概念、方法和应用等方面进行了综述, 以期为同 类研究提供参考。
着 PCR 技术、基因克隆技术和基因组测序技术等的 逐渐成熟与完善, 以及生物信息学等相关学科的发 展与渗透, 环境微生物生态学研究掀开了新的一页。 1986 年, Olsen GJ 等[ 5] 提出, 直接从环境中克隆核 糖体小亚基 DNA( SSU rDNA) , 即 16S r DNA, 从而 开启了以非培养的分子生物学方法研究微生物多样 性的新大门。1991 年, Schmidt TM 等[ 6] 通 过克隆 环境 样品 中 的 DNA 构建 了第 一个 噬菌 体 文库。 1996 年, St ein JL 等[ 7] 用海水中的微生物构建了宏 基因组文库, 并鉴定了一个从未培养过的古细菌的
[ 摘 要] 传统培养方法从环境中只能获得 1% 左右的微生物, 而宏基因组技术作为一种不依赖于培养
的新理念和新方法, 可以克服上述瓶颈, 使从探究环境中获得大量未能培养的微生物成为现实。宏基因组技
术于 10 年前诞生, 至今已取得了令人瞩目的进展。对宏基因组学的概念、方法和应用等方面进行了综述, 以
Key words: met agenome; met agenomics; environmental micr oorganisms
在生物圈中, 微生物占据着重要的地位, 如地化 循环的推动, 生态平衡的维持等。但是, 迄今为止, 人类对微生物的认识还相当肤浅, 与其在生态系统 中的重要性极不相称。由于微生物群落及其栖息环
冲液, 使细胞裂解, 然后从样品中直接提取 DNA 并 纯化的方法。由于该法无需先从样品中分离细胞, 故又称原位裂解法[ 10] 。一般用该方法提取的 DNA 产量较高, 但纯度低, 腐植酸等污染严重, 往往还需 要经过纯化处理才能满足后续分子生物学操作( 如 PCR 扩 增、内 切 酶 切 割) 的 需 要。 此 外, 提 得 的 DNA 片段长度 有限 ( 1 ~ 50 kb) , 适合构 建质粒 文 库。
在宏基因组克隆中, 所谓转化是指通过适当的 方法使宿主细胞处于感受态, 从而摄取重组 DNA 的水平方向的基因转移过程。其方法有 CaCl2法和 电穿孔法。CaCl2 法是 1970 年由 Mandel 和 H iga 首先发现建立的, 用高浓度的 Ca2+ 诱导细胞使其成 为能摄取外源 DNA 的感受状态, 该方法自建立以 来已广泛用于 以大肠杆菌为受体的重 组质粒的转 化, 但该方法转化效率不高。电穿孔法是用高压脉 冲电流击破 宿主 细胞膜 或击 成小孔, 从 而使 外源 DNA 由小孔进入细胞, 该方法转化效率较高。
第 10 期
宋培勇 等 宏基因组技术及其应用研究进展
Leabharlann Baidu15
( environment al DNA, eDNA) 的提取, DNA 提取方 法的好坏直接影响宏基因组文库的质量和代表性。
环境样品 DNA 的提取方法, 尤其是土壤样品 DNA 的提取方法可以分为直接提取法和间接提取法[ 9] 。
1. 1 直接提取法 直接提取法是在环境样品中加入 DNA 提取缓
从 DNA 产量、适合分子生物学操作的 DNA 纯 度和提得的 DNA 对整个微生物群落的代表性等方 面进行客观评 价, 直 接法 和间 接法各 有优 势和 不 足[ 11, 14] 。有关环境 DNA 提取与纯化的方法报道较 多[ 11218] , 总体来看, 国内外学者和研究人员采用直接 提取法的 较多, 尤 其是采 用 Zhou J 等[ 16] 的方法。 然而, 并没有一种标准的或通用的环境 DNA 提取 方法。在实际应用中, 应根据研究生境的特性和研 究目的进行选择和优化。
2. 1 载体系统选择 目前, 常用的 克隆载体有质粒载体( 如 pU C18
和 pU C19) , 插入片段一般小于 10 kb; Cosmid( 黏粒 载体, 如 pWE15) 和 F osmid, 插 入片段 30~ 45 kb; BAC( 细菌人工染色体, 如 pBeloBAC11) , 插入片段 大于 100kb。如何选择合适的载体系统, 应考虑以 下因素: 所提 DNA 的质量及研究目的, 包括欲插入 目的片段的大小、所需要的载体拷贝数、使用的宿主 以及筛选方法等。如对腐殖质含量较高或剪切较严
分别 为 0. 001% ~ 0. 1% 、0. 25% 、0. 1% ~ 1% 、 0. 1% ~ 3% 、1% ~ 15% 、0. 25% 和 0. 3% [ 1] 。对 一 些特殊的微生物群落如生物膜( biofilm) , 直到近几 年才稍有了解, 生物膜是一个组成成分复杂、具有三 维结构和信息传递系统的复杂的社会群体[ 324] 。随
期为同类研究提供参考。
[ 关键词] 宏基因组; 宏基因组学; 环境微生物
[ 中图分类号] Q343. 1
[ 文献标识码] A
The Advance s of Meta genome Technology and Its Applications
SONG P ei2yong1 , MA Li2li2 , WAN G Qing2rong1 , LI Dai1 , WEI Zhi2qin1
( 1. Depar tment of Biology , Zunyi Nor ma l College, Zunyi, Guizhou 563002; 2. College of Lif e Science, Sichuan Nor mal Univer sity , Chendu, Sichua n 610066, China)
3 宏基因组文库筛选
3. 1 功能驱动的筛选 功能驱 动的 筛选 ( Funct ion2driven screening)
即基于活性的筛选。是根据重组克隆产生的新活性 而进行筛选的方法。迄今, 利用功能驱动筛选已从 土壤宏基因组文库中分离到的异源基因产物有: in2 dirubin, violacein, dexyvio2lacein, t yr osine deriva2 t ives 和 turbomycins A/ B[ 21222, 31] 。功能驱动筛选的 优点: 只要基因能在宿主中表达, 就可以根据基因表 达特性进行筛选, 能迅速找到可用于工农业和医药 业的酶等蛋白质和抗生素等天然产物, 在工业上有 很多重要的酶就是用这种方法发现的。主要缺点: 目的基因必须能在宿主中进行功能表达, 而基因表 达与否除了和宿主有关外, 还决定于基因本身的完 整性, 这就要求一方面要选择合适的宿主菌株, 另一 方面要求克隆到基因或基因簇的全长, 一旦克隆过 程中基因的某个组件遭到破坏将使基因无法表达, 也就不能根据表型加以筛选。筛选工作量大、效率
体在宿主细胞中的稳定性, 宿主能否为相关功能基 因提供必需的转录表达体系, 对异源表达基因产物
是否有较强的相容性, 以及目标性状( 如抗菌性) 及 缺陷型等因素。目前, 构建宏基因组文库最常用的 宿主是大肠杆菌( Escher ichi a col i ) , 其次, 变铅青链 霉菌( S tr ept omyces l i vid ans) 和 恶臭 假 单 胞杆 菌 ( P seudomonas p ut ida ) 也可以 作为构 建文库 的宿 主[ 1 9220] 。研究表明, 不同微生物种类所产生的活性 物质有明显差异, 不同的研究目标应选择不同的宿 主菌株。鉴于 70% 的抗生素来源于放线菌的事实, 若以寻找抗菌、抗肿瘤活性物质为目标, 选择链霉菌 为宿主较理想; 而筛选新的酶则采用大肠杆菌为宜。 2. 3 转化
贵州农业科学 2009, 37( 10) : 14~ 18 Guizhou Agricultur al Sciences
[ 文章编号] 100123601( 2009) 102067120014205
宏基因组技术及其应用研究进展
宋培勇1, 马莉莉2 , 王庆容1 , 李 黛1 , 魏志琴1
( 1. 遵义师范学院 生物系, 贵州 遵义 563002; 2. 四川师范大学 生命科学学院, 四川 成都 610066)
重的 DN A 样品适宜构建质粒文库, 小片段 的文库 适用于筛选新的与代谢相关的单基因或小操纵子。
而对于含较大基因簇或大片段的 DNA 样品则适宜 构建 Cosmid、F osmid 或 BAC 文库, 从而筛 选由较 大基因簇编码的复杂代谢途径或能够表征环境中未
培养微生物基因组的较大基因片段。
2. 2 宿主系统选择 宿主菌株的选择主要考虑其转化效率, 重组载
Abstr act: It is known t hat less t han 1% of microorganisms could be obt ained by t radit ional culture approaches. As a new cult ural2independent idea and method, met agenomics at t empts t o overcome t his bott leneck, a lot of un2culturable microorganisms could be obt ained from t he environment . Significant progresses have been achieved since t he metagenome t echnology been int roduced t en years ago. T his paper reviewed the concept , met hodologies, and applicat ions, et c. of metagenomics.
1. 2 间接提取法 间接提取法是先把微生物细胞从环境样品中分
离出来, 再 从微生 物细胞 提取 DNA 并纯化[ 11213] 。 间接提取法所得的 DNA 纯度较高, 但 DNA 产量及 所包含的基因组信息的广泛性不及原位裂解法[ 14] 。 由于间接提 取法提 得的 DNA 片 段长度 相对较 长 ( 20~ 500kb) , 适合构建黏粒( cosmid) 文库和细菌人 工染色体( BAC) 文库。
1 环境样品 DNA 提取
宏基因组学其上游的关键性技术是环境 DNA
[ 收稿日期] 20092 05221; 2009209211 修回
[ 基金项目] 贵州省科学技术基金资助项目/ 贵州石漠化环境中宏基因组文库的构建0 [ 黔科合 J 字( 2008) 2103] [ 作者简介] 宋培勇( 1966- ) , 男, 硕士, 副教授, 从事微生物资源与开发研究。E2mail: py66 song@ 126. com
境的特殊性和复杂性, 在实验室条件下, 难以模拟和 重现其生活的原始环境条件, 致使环境中仍有高达 99% 的微生物未能得到纯培养, 换言之, 通过现有的 分离培养方法获得的微生物估计仅占环境微生物总 体的 1% 左右[ 122] 。海水、淡水、中营养湖水、未污染 河水、活性污泥、沉积物和土壤中微生物的可培养性
16S rRNA 基 因, 成 为宏基 因组学研 究的里 程碑。 1998 年, H andelsman J 等[ 8] 在前人研究的基础上, 正式提出了宏基因组( met agenone) 的概念, 其定义 为/ The genomes of the total microbiot a found in nature0, 即生境中全部微小生 物遗传物质的总和。 与其同义的术语有/ 元基因组0/ 环境基因组0/ 群落 基因组0和/ 生态基因组0等。因此, 1998 年成为公 认的宏基因组学( metagenomics) 元年。所谓宏基因 组学就是利用非培养的分子生物学技术、方法和手 段对宏基因组进行系统研究, 即分析微生物在环境 中的基因组集合, 研究其 群落结构与生态 功能等。 宏基因组 技术流 程为: 1) 从环 境中提 取宏基 因组 DNA; 2) 用核酸内切酶切割成一定长度的 DNA 片 段并连接到合适的载体上; 3) 转化宿主菌, 形成一个 重组的 DNA 文库即宏基因组文库; 4) 宏基因组文 库筛选。宏基因 组技术采取非 培养方 法, 从 DNA 提取入手构建宏基因组文库, 使从研究环境中获得 大量未能培养的微生物成为现实, 极大的推动了环 境微生物生态学的发展, 为人类开发利用自然环境 中微生物基因资源开辟了新的途径。作者对宏基因 学的概念、方法和应用等方面进行了综述, 以期为同 类研究提供参考。
着 PCR 技术、基因克隆技术和基因组测序技术等的 逐渐成熟与完善, 以及生物信息学等相关学科的发 展与渗透, 环境微生物生态学研究掀开了新的一页。 1986 年, Olsen GJ 等[ 5] 提出, 直接从环境中克隆核 糖体小亚基 DNA( SSU rDNA) , 即 16S r DNA, 从而 开启了以非培养的分子生物学方法研究微生物多样 性的新大门。1991 年, Schmidt TM 等[ 6] 通 过克隆 环境 样品 中 的 DNA 构建 了第 一个 噬菌 体 文库。 1996 年, St ein JL 等[ 7] 用海水中的微生物构建了宏 基因组文库, 并鉴定了一个从未培养过的古细菌的
[ 摘 要] 传统培养方法从环境中只能获得 1% 左右的微生物, 而宏基因组技术作为一种不依赖于培养
的新理念和新方法, 可以克服上述瓶颈, 使从探究环境中获得大量未能培养的微生物成为现实。宏基因组技
术于 10 年前诞生, 至今已取得了令人瞩目的进展。对宏基因组学的概念、方法和应用等方面进行了综述, 以
Key words: met agenome; met agenomics; environmental micr oorganisms
在生物圈中, 微生物占据着重要的地位, 如地化 循环的推动, 生态平衡的维持等。但是, 迄今为止, 人类对微生物的认识还相当肤浅, 与其在生态系统 中的重要性极不相称。由于微生物群落及其栖息环
冲液, 使细胞裂解, 然后从样品中直接提取 DNA 并 纯化的方法。由于该法无需先从样品中分离细胞, 故又称原位裂解法[ 10] 。一般用该方法提取的 DNA 产量较高, 但纯度低, 腐植酸等污染严重, 往往还需 要经过纯化处理才能满足后续分子生物学操作( 如 PCR 扩 增、内 切 酶 切 割) 的 需 要。 此 外, 提 得 的 DNA 片段长度 有限 ( 1 ~ 50 kb) , 适合构 建质粒 文 库。
在宏基因组克隆中, 所谓转化是指通过适当的 方法使宿主细胞处于感受态, 从而摄取重组 DNA 的水平方向的基因转移过程。其方法有 CaCl2法和 电穿孔法。CaCl2 法是 1970 年由 Mandel 和 H iga 首先发现建立的, 用高浓度的 Ca2+ 诱导细胞使其成 为能摄取外源 DNA 的感受状态, 该方法自建立以 来已广泛用于 以大肠杆菌为受体的重 组质粒的转 化, 但该方法转化效率不高。电穿孔法是用高压脉 冲电流击破 宿主 细胞膜 或击 成小孔, 从 而使 外源 DNA 由小孔进入细胞, 该方法转化效率较高。
第 10 期
宋培勇 等 宏基因组技术及其应用研究进展
Leabharlann Baidu15
( environment al DNA, eDNA) 的提取, DNA 提取方 法的好坏直接影响宏基因组文库的质量和代表性。
环境样品 DNA 的提取方法, 尤其是土壤样品 DNA 的提取方法可以分为直接提取法和间接提取法[ 9] 。
1. 1 直接提取法 直接提取法是在环境样品中加入 DNA 提取缓
从 DNA 产量、适合分子生物学操作的 DNA 纯 度和提得的 DNA 对整个微生物群落的代表性等方 面进行客观评 价, 直 接法 和间 接法各 有优 势和 不 足[ 11, 14] 。有关环境 DNA 提取与纯化的方法报道较 多[ 11218] , 总体来看, 国内外学者和研究人员采用直接 提取法的 较多, 尤 其是采 用 Zhou J 等[ 16] 的方法。 然而, 并没有一种标准的或通用的环境 DNA 提取 方法。在实际应用中, 应根据研究生境的特性和研 究目的进行选择和优化。