当归多糖的分离纯化及其部分理化性质的研究

当归多糖的分离纯化及其部分理化性质的研究
刘　娟,彭仁王秀,乐　江,田卫群
(武汉大学医学院药理学系,湖北武汉430071)
摘要:目的　对甘肃岷县产当归中获得的当归多糖(ASP)进行分离纯化,并测定其部分理化参数。

方法　采用水煮-醇沉法从新鲜当归中提取当归粗多糖,Sevag法除蛋白,冷冻干燥。

苯酚-硫酸法测定总糖含量;UV法及IR法检测多糖性质;自动旋光仪测定旋光度;采用凝胶渗透色谱-激光光散射联用技术(SEC-LLS)分析多糖的分子量范围及其分布;HP LC鉴定多糖的单糖组分及其相对百分比含量。

结果　所得当归多糖为浅米灰色,无甜味,易溶于水,总糖含量为96.8%;192nm处有明显吸收峰,260、280nm处均无吸收峰,证明被测物为多糖,且不含核酸及蛋白质;红外吸收光谱分析,在3352、2940、1747、1626、1414、1237、1021、536cm-1处表现为典型的多糖吸收峰;旋光度为+94.6°,糖残基间的苷键可能为α-糖苷键;分子量在1×104～111×105之间,80%的组分集中在413×104左右;当归多糖主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和木糖组成,其摩尔比值为17.8∶5.8∶12∶1∶2.2。

结论　所用方法提纯的当归多糖糖含量较高。

关键词:当归多糖;当归;单糖;分离纯化;理化性质
中图分类号:R917文献标识码:A文章编号:1006-0103(2004)06-0412-03
Isolation,purification and partial properties of polysaccharides from Angelica sinensis
LI U Juan,PE NG Ren-xiu,Y UE Jiang,TI AN Wei-
(Department o f Pharmacology,Medical College o f Wuhan Univer sity,Wuhan430071,China)
Abstract:OBJECTIVE　T o is olate and purify the polysaccharides fractions from Angelica sinensis(ASP),and to determine the partial char2 acters.METH ODS　H ot water extracting and ethanol precipitating method were employed to is olate polysaccharides from fresh Angelica sinensis.A fter the rem oval of protein by Sevag method,the purified ASP was dried by frozen drier.The am ount of total carbohydrates of ASP was measured with phenol-sulfuric acid method.FT-IR spectrometry,UV-spectrophotometer,and automatic spectropolarimeter were used to determine the characteristic abs orption and optical rotation of the polysaccharides,respectively.S ize exclusion chromatography with laser light scattering(SEC-LLS)technology was employed to measure the m olecular masses.The m onosaccharides contained in ASP were analysed by HP LC.RESU LTS　The am ount of total carbohydrates in ASP was96.8%.Both UV and IR displayed representative polysaccharides properties.The m olecular weight distribution was1×104-111×105,and eight percent was distributed in413×104.The m onosaccharides constituent of ASP were glucose,arabinose,galactose,rhamnose and xylose,and their m olar proportions were17.8∶5.8∶12∶1∶2.2.CON2 C L USION　The am ount of total carbohydrates is high in ASP distilled by this method.The range of m olecular weight and m onosaccharides constituents of ASP are affirmed.
K ey w ords:Angelica sinensis polysaccharides;Angelica sinensis;M onosaccharides;Is olation;Purification
C LC number:R917Document code:A Article I D:1006-0103(2004)06-0412-03
当归具有活血补血、润肠调经、扶正固本之功效。

从其水溶性部分提取的当归多糖具有丰富的生物活性,包括影响造血系统、调节免疫、抗肿瘤、抗辐射以及促进胃溃疡愈合等[1～4]。

确定当归多糖的分子量范围及单糖组分等性质,是研究其组效关系(constituent-activity relationship,C AR)的重要前提。

现从岷当归中分离纯化出当归多糖,并对其部分理化性质进行了研究。

1　实验部分
1.1　药材、仪器和试剂
岷县当归(甘肃岷县康达有限责任公司)。

UV-1601紫外可见分光光度计(日本岛津);170SX FT-IR型傅立叶变换红外光谱仪(美国尼高力);WZZ-2A型自动旋光仪(上海物理光学仪器厂);77520-01Freezone6冷冻干燥浓缩干胶系统(Labconco, US A);SEC-LLS由多角度光散射仪(M A LLS, DA W N-DSP,Wyatt T echn ology C o,US A,激光波长λ= 630nm),P100型泵(Therm o seperation products),Tsk -GE L G6000PWX L和G4000PWX L(7.8mm×300 mm)型凝胶柱以及示差检测仪RI-150组成;HP LC 系统由LC-6A泵、RI D-6A检测器(日本岛津), Z orbax Carbohydrate Analysis C olumn(Agilent C o,US A)和N2000色谱工作站(浙江大学)组成。

阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、果糖、木糖(中国药品生物制品检定
华西药学杂志
W C J・P S　2004,19(6):412～414
作者简介:刘娟(1979-),女,硕士,从事生化药理及药物代谢研究。

所);其余试剂均为市售分析纯。

1.2　方法
1.2.1　当归多糖的分离纯化　新鲜当归粉碎后脱去表面脂肪,脱脂后滤得残渣,用水煎煮约1h。

水液浓缩至稠膏状,65%乙醇沉淀过滤,所得醇沉物以等量蒸馏水溶解,加10%氢氧化钙溶液调pH10～11,放置过夜,抽滤,滤液用3m ol・L-1硫酸溶液调pH5～6,再抽滤,滤液用85%乙醇沉淀,过滤得醇沉物,将其吸干并迅速移入真空干燥器中减压干燥,得粗当归多糖。

将多糖重新溶于蒸馏水,3000r・min-1离心10min,弃去沉淀。

用Sevag法去蛋白,即溶液中加入氯仿和正丁醇(25∶5∶1),剧烈振荡20min使其充分混匀,然后3000r・min-1离心10min,除去水相与有机相交界处的灰白色变性蛋白。

水相仍按此法反复去蛋白,共6次。

剩余茶色液体再加入4倍体积的无水乙醇,充分振荡摇匀,于4℃静置24h。

弃上清,沉淀部分以无水乙醇洗涤3次至洗涤液呈无色,小心吸弃洗涤液,自然干燥15min,冷冻干燥10h,即得当归多糖(ASP)。

1.2.2　总糖含量测定　采用苯酚-硫酸法,吸取5μg・ml-1的样品液2ml,测定吸光度,通过标准曲线法求得相应糖浓度值,并计算糖含量。

1.2.3　紫外光谱检测　称取冻干ASP样品10mg,置100ml量瓶中,加双蒸水溶解并稀释至刻度,摇匀。

在190～400nm区间进行扫描。

1.2.4　红外光谱检测　称取冻干ASP样品2mg,加入200mg干燥的K Br晶体,在红外灯照射下于研钵中轻轻研磨至极细,用压片机压片,红外分光光度计400～4000cm-1中红外区扫描,测定透光率曲线。

1.2.5　旋光度测定　称取冻干ASP样品100mg,双蒸水定容至10ml(浓度1%)。

用10cm的旋光测定管于自动旋光仪上测定旋光度值。

1.2.6　分子量范围的测定　精密称取冻干ASP样品50mg,溶于10ml生理盐水,配制成浓度为5‰的样品溶液。

以0.9%的NaCl溶液作流动相,流速110 ml・min-1。

所有溶液均先后用砂芯漏斗及012μm 过滤器过滤,并于用前超声脱气。

于25℃进行SEC-LLS测定。

用Astra软件进行数据的采集和分析。

样品在0.9%NaCl溶液中的折光指数增量(dn/ dc)通过OPTI LAB折光仪在632.8nm和25℃测定,样品的dn/dc值为0.133ml・g-1。

1.2.7　单糖组分及含量百分比的测定　准确称取葡萄糖(G lu)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(G al)、木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)和果糖(Fru)各20mg,分别溶于2ml双蒸水中,配制1%标准液。

精密称取冻干ASP 样品20mg,加入2m ol・L-1H2S O46ml,充分溶解后移入刻度试管,密封,于100℃水浴中水解10h。

水解液以固体碳酸钡中和,4000r・min-1离心,留取上清液。

采用HP LC法分析其单糖组分。

分析柱为Z orbax Carbohydrate Analysis C olumn;流动相为乙腈-水(78∶22);流速1.5ml・min-1;进样量20μl;柱温30℃;采用示差折光检测器检测。

由对照单糖标准品的保留时间确定单糖的种类,根据各组分的峰高比值计算相对百分含量。

1.3　结果
1.3.1　当归多糖表观性状　制备后所得当归多糖为浅米灰色疏松状粉末,无味,无香气,易溶于水,其溶液pH6.8,不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。

1.3.2　总糖含量　按文献方法[5]测得多糖含量为96.8%。

1.3.3　紫外光谱检测　ASP在190～400nm的紫外扫描图谱显示,192nm有最大吸收峰,表明被测物为多糖;280、260nm处无吸收,说明多糖中无蛋白质、多肽及核酸。

1.3.4　
红外光谱检测　红外光谱表明,ASP具有典型的多糖特征吸收峰(3352、2940、1747、1626、1413、1273、1105、536cm-1)。

其中,3352cm-1出现的吸收峰主要是由多糖的配糖体羟基(缔和)伸缩振动引起的;2940cm-1处的吸收峰与碳氢键的伸缩振动相对应;1105cm-1处出峰则是碳氧键伸缩振动的特征; 1250～950cm-1之间存在吸收峰,提示糖链构型为吡喃型;810cm-1处无特征吸收,表明多糖的糖基中不存在甘露糖[6](图1)。

图1　当归多糖的红外吸收图谱
Fig1　FT-IR spectrum of Angelica sinensis polysacch arides
314
第6期刘　娟,等。

当归多糖的分离纯化及其部分理化性质研究
1.3.5　旋光度测定　ASP 比旋光度为[α]20D +9416,
具有较大的比旋正数,揭示多糖中糖残基间的苷键为α构型[7]。

1.3.6　分子量测定　SEC -LLS 测定结果表明,ASP 是由3种多糖组分组成的聚合物,其中主要组分占80%,其重均分子量(M w )为4.321e +04。

各组分的数均分子量(Mn )、重均分子量(M w )、分布宽度指数(W I )及百分比范围见表1。

表1　当归多糖3种组分的数均分子量、重均分子量、分布宽度指数及百分比范围
T able 1　The number -average molecular w eight(Mn),w eight -aver 2
age molecular w eight (Mw),distributing w idth index (W I )and percent range of 3fractions of Angelica sinensis polysac 2ch arides
Mn M w W I (M w/Mn )Percent range 9.273×103 1.015×104 1.09510%3.596×104 4.321×104 1.20280%1.132×10
5
1.176×10
5
1.039
10%
1.3.7　单糖组分分析　ASP 水解液的HP LC 谱见图2。

测定结果表明,水解液出峰的保留时间分别与Rha 、Xyl 、Ara 、G lu 和G al 准确对应,说明ASP 中含有
这5种单糖,其摩尔量比值为1∶2.2∶5.8∶17.8∶12。

图2　单糖标准品(A)及当归多糖水解样品(B)的HP LC 图谱
Fig 2　HP LC chrom atograms of chemical stand ards(A)and hy 2
drolysates of Angelica sinensis polysacch arides (B)
1.Rha ;
2.X yl ;
3.Ara ;
4.Fru ;
5.G lu ;
6.G al
2　讨论
采用Sevag 法去蛋白后再次醇沉以及冷冻干燥的方法对传统水煮-醇沉法所提取的当归粗多糖进行纯化,得到的多糖糖含量为96.8%,高于有关的文献报道[8],且步骤较为简便。

其中,冷冻干燥较为关键,能使多糖在低温(-40℃)和减压(40×10-3真
空度)状态下迅速干燥,避免了糖苷键的断裂。

实验还发现,经冷冻干燥后的多糖溶解性明显强于经直
接干燥的多糖。

这是由于缓慢干燥时,存在于多糖
体分子周围的水分子逐渐被抽除,多糖体分子间借次价力而紧密结合,使表观分子量显著增加,从而溶解性能降低。

分离纯化的ASP 属于聚合物(不同分子量组成的同系混合物)。

其测定方法有超离心法、黏度法、动态渗透法等。

其中最简便的是凝胶过滤法,最好的是光散射法[9]。

实验首次采用了凝胶渗透色谱-激光光散射联用技术(SEC -LLS )分析ASP 的分子量及其分布,利用示差和光散射两个检测器同时检测高聚物的查出级分,操作快捷,结果可靠。

多糖的分子量分布形态受聚合方式和聚合因素的影响而有所不同,可用表示多分散程度的参数,如分布宽度指数(W I )表示,W I 越大,多糖分子大小差别就越大,分散程度就越明显[10]。

结果显示,ASP 是由3种具有一定平均分子量的多糖组成,各组分的W I 均在1.5以下,说明每部分的分子量皆较为集中。

实验采用HP LC 法对提自岷当归中的ASP 进行了单糖鉴定,所得分离纯化的ASP 中含有葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和木糖,其含量依次递减,与相关文献[11,12]中所报道的不同ASP 组分的单糖组成一致。

参考文献:
[1]　郑敏,王亚平.当归多糖对人髓系多向造血祖细胞增殖分化
的影响及其机理研究[J ].解剖学杂志,2002,25(2):105[2]　单俊杰,王易.当归多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖及诱生IFN -γ的影响[J ].药学学报,2002,37(7):497[3]　贾敏,商澎.当归多糖AP -0对小鼠移植性肿瘤的抑制作用
[J ].第三军医大学学报,2001,23(11):1299[4]　Y e Y N ,S o H L.E ffect of polysaccharides from Angelica sinensis on
gastric ulcer healing[J ].Life Sciences ,2003,72(8):925
[5]　Zhang W J.Biochemical Research T echnology G lycoconjugate [M].
2nd ed.Hangzhou :Zhejing University Press ,1994116
[6]　彭师奇.药物的波谱解析[M].北京:北京医科大学、中国协
和医科大学联合出版社,1998.81
[7]　张翼伸.多糖的结构测定[J ].生物化学与生物物理进展,
1983,10(5):18
[8]　杨兴斌,梅其炳,周四元,等.当归多糖质控中糖含量测定方法
的建立与评价[J ].中国新医药,2003,2(8):3[9]　方积年.多糖的分离纯化及其纯度鉴别与分子量测定[J ].药
学通报,1984,19(10):46[10]　于世林.高效液相色谱方法及应用[M].北京:化学工业出版
社,1999.159[11]　陈汝贤,徐桂云,王海燕,等.当归多糖XC -1的分离与结构
研究[J ].化学通报,2001,6:372
[12]　陈汝贤,王海燕,许鸿章,等.岷当归两个多糖组分的分离、纯
化与鉴定[J ].中药材,2001,24(1):36
收稿日期:2004-09
4
14 华西药学杂志第19卷。