研究蛋白质凝聚凝胶的技术进展

研究蛋白质凝聚凝胶的技术进展

摘要由于蛋白质形成的凝胶会影响食品的质构和品质,所以研究蛋白质凝胶对于食品科学有极其重要的意义。然而,蛋白质形成凝胶的机理过于复杂,需要更先进的技术来研究。介绍了用于蛋白质凝胶研究的最新技术进展,如原子力显微镜(AFM),共聚焦激光

显微镜(CSLM)和漫射波光谱(DWS)。与传统研究凝胶的方法如动态流变仪和扫描电子

显微镜(SEM)相比,这些新方法简化了样品的预处理,有实现在线测定的可能。由于样品

处于天然状态,所以反映的信息更具有真实性,加上高分辨率,可以实现蛋白形成凝胶过

程分子水平的可视化。因此,采用以上的新技术可以为研究蛋白凝胶的形成提供更多的

信息。

凝聚和凝胶过程对食品加工起着重要的作用,它们能形成食品所需要的质构,也

会带来不需要的沉淀或是分层现象。因此,研究胶体形成的特性对于稳定和形成食品所需结构十分重要,并且通过控制凝胶反应优化食品加工过程,提高食品品质。对于食品体系的凝胶和凝聚已经有了深入的研究,但凝聚凝胶现象还鲜有报道。因为研究凝胶过程有以下困难:首先,蛋白和多糖是大分子,三维结构描述和定量困难。其次,凝胶过程是一

个复杂的反应体系[1]。例如,球蛋白的凝胶过程,通常分为蛋白分子展开,解聚和聚合,凝聚[2]的步骤。在热变性的过程中,天然蛋白分子伸展,暴露出功能性基团(如巯基和疏水基团)。随后,为了降低体系的能量,蛋白通过形成二硫键或疏水相互作用发生凝聚[3-4]。当蛋白浓度高于形成凝胶的临界点时,凝聚继续发展形成凝胶结构。在整个反应过程中,最终的凝胶和凝聚体的结构受环境因素影响(蛋白浓度、pH、离子强度、温度等)很大。食品是个复杂的体系,一些成分会影响蛋白凝聚凝胶的过程如蛋白—蛋白的相互作用,通过改变二硫键形成、疏水相互作用、氢键或是范德华力,改变形成凝胶体的凝胶特性[5]。此外,采用传统的分析手段难以获得更加深入真实的凝胶形成信息。尽管采用动态流变仪、显微镜和动态光散射技术可以分析凝胶形成过程,但是这些方法主要通过分析凝聚发生过程时粒子尺寸或是弹性模量G′的变化来进行研究[6-9],通常需要复杂繁琐的样品前处理过程,如稀释、机械变形、干燥、冻干等,这些处理会破坏易破碎的弱凝胶,影响

亚稳定体系。因此,保持体系接近原始天然状态对于考察物理化学因素对于凝胶最终质构的影响十分重要。理想的分析方法应该是非破坏性的、非干扰性的技术,可以让样品处于天然状态下测定,从而获得处于软凝胶状态下,凝胶相互作用的信息[10]。伴随科技的发展,一些新的非破坏性的技术应用于蛋白质凝胶和凝聚的研究中。文章论述了原子

力显微镜(AFM),激光共聚焦显微镜(CSLM)和散射光波谱(DWS)用于食品蛋白质凝聚凝

胶的研究。在我国,虽然原子力显微镜已经广泛用于多糖结构的研究[11-13],但是用于

蛋白质凝胶和凝聚的研究报道还很少。

1AFM用于蛋白质凝聚凝胶

AFM起源于隧道扫描显微镜技术,它广泛应用于生物、物质结构、分子生物学等领域。AFM用于食品科学中以下六个方面[14]:AFM可以定性描述食品大分子的结构;

通过AFM成像提供的结构参数描述食品加工和储存过程中定量分析分子结构变化;显

示不同分子之间的相互作用;为操控食品大分子提供条件;描述食品表面因物理特性变化而带来的细微变化;加工纳米食品的工具。

1. 1AFM的原理

AFM的成像是通过“感觉”而非“观察”样品。在AFM观测样品时,一个安装

在悬臂上的尖端扫描样品表面,通过记录悬臂的偏斜,通过激光二极管发出的激光照射在悬臂的末端,经过镜面反射把激光发射到光电二极管检测器上,得到悬臂偏斜的信号。当扫描样品时,样品表面的拓扑结构通过尖端和样品力的变化使悬臂发生偏斜。通过电脑处理悬臂偏斜变化形成样品表面三维结构[15]。

AFM的观测模式有三种:接触、非接触和轻敲。在接触模式中,尖端始终与样品

表面接触,而非接触模式中,悬于空气中的尖端仅于样品表面吸附水层接触而不与样品接触。轻敲模式中,尖端与样品间歇接触,通常每秒接触300 000次,减少接触模式中产生

的剪切力对于样品的破坏,这种模式通常适宜那些质地偏软的食品和生物样品。

1. 2AFM的特点

与传统的电子和普通光学显微镜相比,AFM具有以下优点[14, 16]。

①具有高分辨率和大的放大倍数。AFM没有透镜,因此不受衍射极限或者球面像差的限制,对于某些样品可以实现原子级别的分辨率。

②简化样品处理的过程。AFM是非破坏的分析方法,不需要染色或是覆膜处理,也不用高能量的粒子流,不需要导电衬底,不受样品稠度的影响,观测时样品可以处于溶液中,基本

达到在天然状态下或是近似天然状态下观测样品。

③可同时得到样品的二维和三维成像。

④可以连续的观测样品变化,所以可以直接观测正在进行的反应过程。如酶反应的过程。

⑤为操控大分子和调查大分子之间的相互作用提供了可能。

然而,目前AFM也有以下缺点:相对较小的扫描面积,较慢的扫描速度,对于过于

软的样品成像困难等

1. 3AFM在蛋白凝聚和凝胶上的应用

AFM能有效地提供凝胶结构信息,进而补充流变仪或化学分析蛋白凝聚结构信息。AFM可以成功的反映乳清蛋白热凝聚现象,研究发现乳清蛋白凝聚体显示了同β-乳球蛋白凝聚体相似的微观结构[17]。在pH 7时,无论NaCl浓度如何变化,乳清蛋白凝聚体主要由椭球形微粒构成。以上研究结果对于理解不同条件下得到的热导致乳清蛋白凝胶

特性差异提供了基础。

采用轻敲模式AFM观察到加热后β-乳球蛋白,发现它形成一种有规律的纤维结构,长度约25nm,厚度是1或2个蛋白单体[14]。这证明在低pH低离子强度下,形成的

热导致β-乳球蛋白纤维体需要进行两步以上的反应。

Iwasaki等[14]采用AFM分析加热对于肌浆球蛋白丝形态的影响,发现在70℃时原来的串珠结构变成绳子结构,但是少量蛋白丝的结构没有明显变化。