疟疾检验技术
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实验室技术
●分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是 确诊疟疾的“金标准” 仍然是血液显微 镜检查 ●显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方 法 ●厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代 的疟疾诊断的金标准
血片制作
厚薄血膜的制作
在制作血片前，首先要核对患者的姓名、 年龄和住址
取血部位和血量
采血部位和取血方法：耳垂 或无名指，通常在耳垂取 血，先用75%酒精棉球消毒 取血部位，待酒精干后， 用左手拇指和食指紧捏耳 垂上方或无名指指尖，右 手持消毒针迅速刺入皮肤， 不宜过深或过浅。然后用 右手中指轻轻挤压出血。 厚血膜血量约一粒米大小。
成批血片染色
将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3% 吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97 毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min （根据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓 度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标
本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜
检。
质量好的染色 : 核呈红色,胞浆呈蓝色 如果血片偏红,说明染液偏酸性 如果血片偏蓝,说明染液偏硷性
胞为数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为：
35（原虫数）x 8000÷200（白细胞数） =1400 / μl 答：该患者原虫密度为1400 / μl。
红细胞感染率计算法（薄血膜）
薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较 大差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度 常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜 只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。
●白细胞疟原虫计算公式： 疟原虫数 × 患者每微升血的白细胞数 ÷ 计数的白 细胞数 = 疟原虫数/μl血。
● 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8 000个白 细胞计数(国际标准) 。
白细胞疟原虫计数法举例
●假设计数200 WBC中有35个疟原虫，在不知患 者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细
白细胞疟原虫密度计数法（WHO推荐）
白细胞疟原虫密度计数法重要性
● 用于疟疾研究
● 用于临床诊断
● 用于抗疟后疟疾考核
白细胞疟原虫密度计数法（WHO推荐）
●在厚血膜，按要求选择视野，计数200个白细胞中的 疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度 较低，可增加白细胞计数（500~ 1 000 个）。
正确的推片姿势
标准的疟疾厚薄血膜片位置
各种不同的疟疾血片涂制法： 标准血片
门诊发热病人血片
居民普查血片
厚薄血膜的标准
●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 ●薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列
血片染色
两种染色方法:
●吉氏染色法 ●瑞氏染色法
Байду номын сангаас
常用吉氏染色法
吉氏染液(原液)的配置
吉氏染粉 (Azure B type) 5g 甘油 (纯 ) 250ml 甲醇 (纯) 250ml
● 固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜 ● 冲洗染液时，不要冲走厚血膜。
原虫密度计算
估计疟原虫感染程度有三种方法： ●半定量计数法 检查厚血膜 ●白细胞原虫密度计数法 检查厚血膜 ●红细胞感染率计算法 检查薄血膜
半定量计数法
用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略 地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数 的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定 量分析。 国内常用。此方法将密度分为6级： 1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字 2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视 野不到1个虫，记录“少” 3.平均每个视野1~5个虫，记录“＋” 4.平均每个视野6~10个虫，记录“++” 5. 平均每个视野11~100个虫，记录“+++ ” 6. 平均每个视野100个虫以上，记录“++++ ”。
镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫 虫期，不要笼统地记录为Pv或Pf。
红细胞感染率计算法（薄血膜）
1. 按以下公式计算： 红细胞原虫感染率（%）= 疟原虫数 X 100 ÷ 计数的红细胞数 2. 显微镜下选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视 野（ 300-500红细胞/视野） 3. 按一定顺序移动血片记数红细胞的同时，记录疟 原虫数
外观吉氏染色血片
染色过程
血片干燥后, 用甲醇固定薄血膜。
将血片平置于染色板上。 用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血 膜上，染色10 min。 用清水细缓冲去染液。 置玻片于插板上，自然晾干。
血片制作与染色注意事项
●使用前载玻片一定要清洁，不然会影响 血 片制作和镜检结果． ●厚血膜干燥时不要加热，加热会使原虫变形， 影响镜检结果． ●配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提 高镜检质量．
厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4微升 血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的 载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4 圈，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜。 薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血 膜适当远的地方.将采血玻片(推片)的边缘紧贴 载玻片使 血液沿边缘散开(如图示).
整个染色液配制时间不能少于5个小时
稀释吉氏原液
●原液需经pH7.0盐酸缓冲液（PBS）或 净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。 ●吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀 物泛起影响染色效果.
吉氏染液浓度
门诊染色
操作1 （快染） 配制5%染液，（每张血片约需染 液2ml）：量筒内量2ml缓冲液或净水，直接滴 加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血 膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。 操作2 (慢染) 在染色量筒内量2ml蒸馏水或净水， 再 滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染 色30~40min。清水细缓冲洗，晾干镜检。
吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨， 直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入 少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗， 反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置 于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保 存时间越长染色效果越好。
4. 如果能见到疟原虫，但是记数5000～10000个红细胞 时却没有感染红细胞，那么设定感染率为＜１％
●分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是 确诊疟疾的“金标准” 仍然是血液显微 镜检查 ●显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方 法 ●厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代 的疟疾诊断的金标准
血片制作
厚薄血膜的制作
在制作血片前，首先要核对患者的姓名、 年龄和住址
取血部位和血量
采血部位和取血方法：耳垂 或无名指，通常在耳垂取 血，先用75%酒精棉球消毒 取血部位，待酒精干后， 用左手拇指和食指紧捏耳 垂上方或无名指指尖，右 手持消毒针迅速刺入皮肤， 不宜过深或过浅。然后用 右手中指轻轻挤压出血。 厚血膜血量约一粒米大小。
成批血片染色
将已用甲醇固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3% 吉氏染液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水97 毫升，混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min （根据当地实际情况，酌情增减染色时间和浓 度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标
本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜
检。
质量好的染色 : 核呈红色,胞浆呈蓝色 如果血片偏红,说明染液偏酸性 如果血片偏蓝,说明染液偏硷性
胞为数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为：
35（原虫数）x 8000÷200（白细胞数） =1400 / μl 答：该患者原虫密度为1400 / μl。
红细胞感染率计算法（薄血膜）
薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较 大差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度 常比前半部或中央部高，所以，镜检时不宜 只检查一个角落，应顺玻片的横轴检查。
●白细胞疟原虫计算公式： 疟原虫数 × 患者每微升血的白细胞数 ÷ 计数的白 细胞数 = 疟原虫数/μl血。
● 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8 000个白 细胞计数(国际标准) 。
白细胞疟原虫计数法举例
●假设计数200 WBC中有35个疟原虫，在不知患 者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细
白细胞疟原虫密度计数法（WHO推荐）
白细胞疟原虫密度计数法重要性
● 用于疟疾研究
● 用于临床诊断
● 用于抗疟后疟疾考核
白细胞疟原虫密度计数法（WHO推荐）
●在厚血膜，按要求选择视野，计数200个白细胞中的 疟原虫数（可分有性体和无性体），如果原虫密度 较低，可增加白细胞计数（500~ 1 000 个）。
正确的推片姿势
标准的疟疾厚薄血膜片位置
各种不同的疟疾血片涂制法： 标准血片
门诊发热病人血片
居民普查血片
厚薄血膜的标准
●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 ●薄血膜平整,无皱折和空泡.红细胞单层排列
血片染色
两种染色方法:
●吉氏染色法 ●瑞氏染色法
Байду номын сангаас
常用吉氏染色法
吉氏染液(原液)的配置
吉氏染粉 (Azure B type) 5g 甘油 (纯 ) 250ml 甲醇 (纯) 250ml
● 固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜 ● 冲洗染液时，不要冲走厚血膜。
原虫密度计算
估计疟原虫感染程度有三种方法： ●半定量计数法 检查厚血膜 ●白细胞原虫密度计数法 检查厚血膜 ●红细胞感染率计算法 检查薄血膜
半定量计数法
用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略 地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数 的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定 量分析。 国内常用。此方法将密度分为6级： 1.全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字 2.全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视 野不到1个虫，记录“少” 3.平均每个视野1~5个虫，记录“＋” 4.平均每个视野6~10个虫，记录“++” 5. 平均每个视野11~100个虫，记录“+++ ” 6. 平均每个视野100个虫以上，记录“++++ ”。
镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫 虫期，不要笼统地记录为Pv或Pf。
红细胞感染率计算法（薄血膜）
1. 按以下公式计算： 红细胞原虫感染率（%）= 疟原虫数 X 100 ÷ 计数的红细胞数 2. 显微镜下选择红细胞排列整齐密集，无重迭的视 野（ 300-500红细胞/视野） 3. 按一定顺序移动血片记数红细胞的同时，记录疟 原虫数
外观吉氏染色血片
染色过程
血片干燥后, 用甲醇固定薄血膜。
将血片平置于染色板上。 用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血 膜上，染色10 min。 用清水细缓冲去染液。 置玻片于插板上，自然晾干。
血片制作与染色注意事项
●使用前载玻片一定要清洁，不然会影响 血 片制作和镜检结果． ●厚血膜干燥时不要加热，加热会使原虫变形， 影响镜检结果． ●配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提 高镜检质量．
厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约4微升 血量（相当于火柴头大小），使血滴与平置的 载玻片接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4 圈，涂成直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜。 薄血膜再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血 膜适当远的地方.将采血玻片(推片)的边缘紧贴 载玻片使 血液沿边缘散开(如图示).
整个染色液配制时间不能少于5个小时
稀释吉氏原液
●原液需经pH7.0盐酸缓冲液（PBS）或 净水稀释后，方可用于厚薄血片染色。 ●吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀 物泛起影响染色效果.
吉氏染液浓度
门诊染色
操作1 （快染） 配制5%染液，（每张血片约需染 液2ml）：量筒内量2ml缓冲液或净水，直接滴 加吉氏原液7滴，混匀，滴入待染标本的厚薄血 膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾干镜检。 操作2 (慢染) 在染色量筒内量2ml蒸馏水或净水， 再 滴加吉氏原液4滴，混匀，滴入待染标本上，染 色30~40min。清水细缓冲洗，晾干镜检。
吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨， 直至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入 少许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗， 反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置 于室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保 存时间越长染色效果越好。
4. 如果能见到疟原虫，但是记数5000～10000个红细胞 时却没有感染红细胞，那么设定感染率为＜１％