玉米种子纯度SSR分子标记鉴定方法

辣椒种子纯度

SSR分子标记鉴定技术规程

编制说明

沈阳市农业科学院

2017年5月

《辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定技术规程》

标准编制说明

一、工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、主要起草人及其所做的工作；

2016年5月沈阳市农业科学院通过辽宁省农村经济委员会和沈阳市质量监督局向辽宁省质量技术监督局提交《项目建议书》，建议编制《辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定技术规程》标准。经审查及公示，项目被列入辽宁省地方标准制修订2017年度计划，立项编号为2016073，沈阳市农业科学院为项目承担单位。

项目立项后，项目承担单位成立了标准起草小组，落实了标准起草经费，提供了必要的工作条件。标准起草小组的成员有：杨双、张曼丽、刘延斌、李金凤、马东梅、潘菊、胡颖、孙嘉兴、李雪、宋伟。杨双为技术总负责；李金凤、马东梅负责标准样品收集；潘菊、胡颖负责技术资料检索；刘延斌、孙嘉兴、李雪负责标准技术参数确定。标准起草小组在批准立项的一个月内制定了具体的标准起草计划。按照计划，2016年12月前完成资料收集、相关调研及试验验证；2017年4月聘请省内农业专家对征求意见稿进行修改；5月完成意见整理、分析和处理，填写地方标准征求意见汇总表；5月申请专家审查。

二、标准编制原则和确定地方标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则）的依据。地方标准修订项目，还应列出和原标准主要差异情况；

辣椒(Capsicum annuum L.)是辽宁省八大蔬菜作物之一，省内广泛种植，随着辣椒杂交种的种植面积不断扩大，种子纯度问题显得尤其重要。在辣椒制种过程中，无论使用两系杂交或者三系杂交，杂交一代种子中易于混入母本种子。由于亲本的生产力弱，产量低，纯度不够的种子对辣椒生产造成影响。在辣椒生产过程中，常常出现因种子纯度不高造成产量降低、品质变劣，商品性不好，严重影响经济效益。因此，大力开展辣椒种子纯度检测工作显得尤其重要。目前鉴定辣椒种子纯度一般采用田间种植或室内酯酶同工酶电泳等方法，这些方法虽简便易行，但田间种植仅靠形态观察较难做到准确判断，且耗时长，同工酶检测也会因环境和发育时期而发生变化，导致电泳结果不易判读。建议制定基于DNA多态性，依托SSR分子标记技术，具有快速、准确、易操作等特点的鉴定辣椒种子纯度技术规程，适用于省内主栽的辣椒品种的纯度鉴定，提高商品种子质量，为质量监督管理部门提供参考，同时也为辣椒品种指纹图谱的建立和品种知识产权的保护打下基础。

SSR（Simple Sequence Repeat）是一类由几个（多为1-6个）碱基组成的基本单元串联重复形成，广泛存在于真核生物的基因组中。由于个体基因组中每个SSR位点的重复单元在数量上存在多态性，可用于鉴别不同个体。基因组中这些SSR位点的侧翼DNA片段通常都是保守性较强的单一序列，可以根据侧翼的DNA片段的碱基序列设计引物，进行PCR扩增，将单个SSR位点扩增出来。不同个体的扩增产物在长度上的变化就产生多态性，可用来鉴别不同个体。

辣椒属于被子植物。根据被子植物发育原理，种皮是由珠被发育来的，其细胞内的2N条染色体全部来自母本；胚是由受精卵发育来的，其细胞内的2N条染色体一半来自卵细胞（母方），一半来自精子（父方）；胚乳是由受精的极核发育来的，其细胞内的3N条染色体有2N条来自极核（母方），N条来自精子（父方）。这样1粒杂交一代的种子的种皮为母本基因型，胚为杂交种基因型，在实际应用中，不需要提供亲本也可以通过杂交种获得亲本基因型数据。

三、主要试验（或验证）的分析报告、相关技术和经济影响论证、预期的社会经济效益；

1.DNA制备方法

植物体任何部分都可以用来提取DNA，但是幼叶相对容易，种子和种皮相对较难，因为种皮中含有大量纤维素，细胞壁厚，裂解难。解决种子和种皮的DNA提取是本研究的难点。

采用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒，种子和种皮提取时，通过延长裂解时间，取消漂洗步骤，无菌水反复冲洗等步骤，以期减少DNA损失，提高DNA提取量。提取幼叶时正常按照说明书提取。

用纯水浸泡辣椒种子过夜，剥取辣椒种皮及种子20mg左右（约5粒左右）至2.0ml离心管中，将液氮加入其中并迅速研碎，加入裂解液LP1，原裂解时间为10min，改为20min，取消漂洗过程，其余操作步骤同试剂盒说明。

幼叶取100mg左右，按照试剂盒说明书步骤提取。

用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量，结果如图1所

示。

图1 DNA电泳结果

注：1，2，3—种皮；4，5，6—种子；7，8，9—幼叶

结果显示，以植株幼叶为材料获得的DNA质量最好，但是从种子催芽到萌发需要2周左右时间，耗时长。以种子、种皮为材料获得的DNA相对幼叶较少，但也可见清晰条带。

2．纯度鉴定技术

参考管俊娇等（2014）、刘子记等（2014）及李晶晶（2009）的相关研究，结合http：//网站公布的辣椒分子标记的相关信息，获得多态性SSR引物。利用辽宁省栽培面积最大的麻辣椒沈椒4号、某大牛角、某甜椒作为研究材料，开展纯度鉴定研究。

2.1 反应体系

总体积10 μL，包括5μL 2×Taq PCR Mix (with Dye)、1μL 引物（10 μmol/L）、2μL DNA、2μL超纯水，混匀。

2.2 反应程序

94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸2min；4℃保存。

2.3 引物筛选及结果

选用20对SSR引物对沈椒4辣椒的种皮和杂交种子的DNA进行

扩增，结果发现，有4对引物的扩增条带在两个样品中出现明显差异，且图谱中条带较少，易于判断，见图2。

图2 沈椒4号的种皮与种子DNA的SSR标记

3. 纯度检测

选择上述1对差异引物对48粒种子样品进行检测，通过PCR及电泳，获得凝胶照片，见图3。

图3 沈椒4号纯度检测电泳结果

结果见图，从图可见，第2粒为亲本、第37粒为外源杂。

4. 不同品种进行验证

利用上述方法，分别检测某大牛角（图4）、某甜椒品种（图5），经验证该方法可用于检测不同类型辣椒品种的纯度。

图4 大牛角纯度检测电泳结果

图5 甜椒纯度检测电泳结果

综上，上述方法可以实现检测的简易化、规范化和标准化。调查资料及检测结果也显示，此检测方法有重复性好且操作简单等诸多优势，能够解决辣椒种子商品化过程中问题，可预见该检测技术的推广