酶工程3 第三章：酶的分离纯化

3.3.1 细胞破碎的方法
机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 酶促破碎法 P72-73
3.3.2酶提取的方法
根据酶的溶解性质，选择适当的溶剂。
盐溶液提取法 酸溶液提取法 碱溶液提取法 有机溶剂提取法 p76
3.3.3影响酶提取的主要因素
1 提取目标:提高提取率减少酶活损失。 1)温度：温度过高易导至酶失活，应控制在0－
1 分离过程中新设备、新技术的应用会取得 事半功倍的效果。如离心机、过滤机的选择。 采用膜分离技术等。
2. 浓缩与干燥过程尽量使用低温过程减少酶失 活，同时可添加一些保护剂以减少酶失活。
3.4 沉淀分离
沉淀分离方法： 盐析沉淀 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 复合沉淀 选择性变性剂沉淀
收集沉淀
10℃，对于稳定性高的酶提高温度有利于提 取。
2）pH:pH应远离等电点以提高溶解度，但pH 不宜过高或过低，防止酶失活。
3) 提取液用量：用量增加，提取率增加但分离 成本提高。一般为原液的3-5倍
4) 添加保护剂：加入适量的酶作用底物、辅酶 或抗氧化剂可以提高酶稳定性，减少酶活损 失。
提取时的注意事项
N－末端分析 只适用于一条肽链
免疫技术 高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦
3.3分离与纯化
分离（提取）：在一定条件下，用适当的
溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中。
纯化：通常先根据溶解度性质用沉淀的方法
（如盐析、有机溶剂沉淀等），制得粗酶， 再根据酶分子的大小、电荷性质、亲和专一 性，将酶纯化。
过滤
非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质
3.5 离心分离
借助于离心机旋转所产生的离心力，使 不同大小密度的物质分离的技术。
常用于：细胞收集、细胞碎片和沉淀的 分离及酶的纯化。
选择离心分离注意选择适当的离心机、 离心方法离心条件。
3.5.1 离心机的种类和用途
2、密度梯度离心p82
是样品在密度梯度介质中进行离心的方
法。能使沉降系数比较接近的物质得以
分离。
ρ0
不同大小和形
状的颗粒在密
度梯度溶夜中
形成若干条界
ρn
面清楚的区带
Ρ0<ρ1。。。<ρn线性梯度离心 还有凹形梯度和凸形梯度。
密度梯度系统
可在溶剂中加入一定的溶质制成密度梯 度系统。要求介质有足够大的溶解度， 不与组分反应，且不会引起分离组分的 凝集、变性或失活。常用的介质有蔗糖 和甘油。蔗糖的梯度范围为：浓度 5%~60%，密度为1.02~1.30g/cm3
3、等密度梯度离心p83
当分离组分的密度ρ<ρi时颗粒上浮而 ρ>ρi时下沉，而ρ=ρi颗粒停留在该处形 成区带。使得待分离的物质ρ处于离心 介质等密度处ρi形成区带的离心方法。 要求溶液的密度比较大要等于分离组分 的密度，因此常用銫盐如CsCl、Cs2SO4、 CsBr等
当分离组分的密度已知则可直接用等密 度离心而不用梯度。
实用价值
酶的纯度
＜－－侧重科研
3.2.1 酶总活力回收率与提纯倍数
1 总活力的回收率：反映提纯过程酶活 力的损失情况。
总活力的回收率＝纯化后总活力/纯化前总活
力*100%
2 提纯倍数：反映纯化方法的效率
纯化倍数＝纯化后的比活/纯化前的比活
示例：
腺苷酸激酶纯化表（6kg猪肉）
ml mg katal katal/kg
%
纯化步骤 总体积 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率
抽提 16600 43500 0.0413 0.95 1
100
调pH 15700 11200
3.25
层析 1380 1716
13.02
凝胶过滤 211 462
结晶 -
344
43.17 46.5
3.2.2 酶的纯度检验
注意标明使用何种方法检验的.
分析用超速离心机可用于样品纯度的检 测、沉降系数和分子量的测定。分析用 超速离心机一般都装有光学检测系统， 自动记录仪和数据处理系统等。
沉降系数
单位离心力作用下，粒子的沉降速度。 SvedbX2 ln X1
2 t2 t1
ω角速度，t2-t1离心时间，X1,X2粒子距 中心轴的距离
不同方法检验的纯度可能不一致。如电泳纯、层析 纯、HPLC纯。
常用的检验酶纯度的方法
方法
特点
超速离心 检测杂质＜5%时不太满意，不适合络合解离体系
电泳
必须在多种pH值下进行，单一pH两种酶可能一 起移动
SDS－电泳 可测出分子量，多亚基时会出现多条区带
等电聚焦 检测杂的极灵敏方法，有时会出现表观异质现象
常速离心机：转速在8000r/min内
高速离心机：转速在1x104~2.5x104r/min内,高 速离心会导致温度升高因为防止酶等失活， 有的装有冷冻装置。
超速离心机：转速在2.5x104~8x104 r/min内， 都装有冷冻装置，和其它一些控制系统。
常速离心机
高速离心机
超速离心机
超速离心机又可分为制备用超速离心机， 分析用超速离心机，分析制备两用超速 离心机。
3.5.2 离心方法的选择p82
常速和高速离心机只要选择合适的速度 和时间就可以了而对于超速离心机离心 方法可分为差速离心、密度梯度离心和 等密度梯度离心。
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使沉 降速度不同的颗粒分批分离的方法。 主要用于分离大小和密度差异较大的颗 粒。操作简单方便，但分离效果较差， 并使沉降的颗粒受到挤压。
3.5.3 离心条件的确定
离心力 离心时间 温度和pH：防止酶凝集、变性和失活。
温度通常在低温下进行，高速和超速离 心必须采用冷冻系统，防止发热。 pH 应控制在酶稳定的范围内，同时要尽量 不采用过酸或过碱溶液，避免对转子或 离心机腐蚀。
3.6 电泳
主要用于酶的纯度鉴定、酶分子量测定、 酶等电点测定及小批量酶的分离纯化。 常用的是凝胶电泳和等电聚焦电泳。
酶工程3 第三章：酶的分离纯化
要点：
酶主要还是蛋白质，能用于蛋白质的分 离纯化方法通常可用于酶。
要尽量减少酶活损失。 要分清是胞内酶还是胞外酶 根据酶的用途采用不同的方法
3.1 酶分离纯化流程
酶原液 预处理
胞内酶 细胞分离
否 细胞破碎 提取 分离
干燥 浓缩
3.2 酶纯度的评价
总活力的回收率 比活力提高的倍数