酶活力及其动力学常数的测定

酶催化活性最大 时的环境pH。
0
2
4
6
8
10
pH对某些酶活性的影响
pH
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二、酶活力的测定方法

(一)总则 ①有可被检测且能反映酶反应进行程度的信号物 ②底物对酶远远过量(通常底物浓度为Km的3～l0倍) ③适宜的反应温度 ④最适pH反应体系 ⑤被测的酶量适当
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(二)酶的测活方法 1．静态法： 在一定条件下将酶和底物作用一定时间后终止 反应，然后直接或间接地检测底物的减少(或 产物的增加)量，从而计算出酶的活力
I.
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速度的影响呈矩形双曲线关系。
V
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Vmax
[S] 当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比；反 应为一级反应。
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V
Vmax
[S]
随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速；反应 为混合级反应。
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V
Vmax
[S]
当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度； 反应为零级反应
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此法测活的关键步骤是反应多长时间后终止反应 为解决这一问题，首先应在较高酶浓度下启动反应(曲线3)， 于不同的反应时间终止反应，然后作出产物浓度一时间曲线 找出产物随时间线性增加的最长时间t。 在正式测活中，选用低于此酶量的样品，反应到t。(或小于t。)时终止反应 即可得到正确的酶活性
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量的衡量标准

三、酶的转换常数
①分子活性：每摩尔酶分子、每分钟转换底物
的摩尔数 ②催化中心活性：每摩尔活性亚基或催化中心 每分钟转换底物的摩尔数
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四、Km
Km是酶活性部位的一半被底物占据或酶反应 达到最大反应速度一半时所需要的底物浓度， 是一定温度下酶的特征常数，又称米氏常数。
同一酶的不同底物有不同的Km。
第九章
酶活力及其动力学常数的测定
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酶是具有催化活性的蛋白质

酶学研究是现代分子生物学不可缺少的内容。
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酶学研究的意义表现在

①研究酶结构和功能的关系，
②分析酶的改变和疾病的关系
③研究酶在发育及分化中的作用，
④酶标已成为现代分子生物学研究常用的工具
⑤由于酶是其基因表达的产物

1/Km表示酶底亲和常数， 1/Km愈大，则亲
和力愈大
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五、V及Vm

V是反应速度。指单位时间内 (如1分钟) 每毫
克酶蛋白转换底物的μmol数

Vm表示在一定酶浓度和反应条件下的最大反
应速度，是底物浓度足够大时，酶反应速度趋
向的极限值
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第二节 酶活力的测定方法
影响因素包括有
酶浓度、底物浓度、pH、温度、
c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
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Vmax
定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应
速度，与酶浓度成正比。
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（三）Ｋm值与Ｖmax值的测定 1. 双倒数作图法(double reciprocal plot)， 又称为 林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法
V= Vmax[S]
Km+[S]
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（一）米－曼氏方程式
酶促反应模式——中间产物学说
k1 k2 k3
E+S
ES
E+P
中间产物
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※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底
物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程 式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。
Ｖ＝ ── K + [S]
m
Vmax[S]
[S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应速度
Vmax：最大反应速度(maximum velocity)
Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
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（二）Km与Vmax的意义 Km值
① Km等于酶促反应速度为最大反应速度 一半时的底物浓度。 ② 意义：
a) Km是酶的特征性常数之一；
b) Km可近似表示酶对底物的亲和力；
⑥对酶工业的指导作用
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第一节 基本概念

一、酶活力
指酶的催化活性。一般用国际单位表示。第五
届国际生化会议推荐：在一定条件(温度和pH)
下，1分钟转化lμmol底物所需的酶量为一个
酶单位(1U)
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二、酶的比活力
指每毫克蛋白中含有的酶活力单位数，用
IU(U)/mg表示。酶的比活力是酶浓度和酶质
两边同取倒数
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二、酶浓度对反应速度的影响
当 [S] ＞＞ [E] ，酶可 V
被底物饱和的情况下，
反应速度与酶浓度成
正比。
关系式为： V
= K3
0
[E]
当[S]>>[E]时，Vmax = k3 [E]
[E]
酶浓度对反应速度的影响
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三、温度对反应速度的影响
双重影响
温度升高，酶促反 应速度升高；由于酶的 本质是蛋白质，温度升 高，可引起酶的变性， 从而反应速度降低 。

抑制剂、激活剂等。
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
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一、底物浓度对反应速度的影响
研究前提 单底物、单产物反应 II. 酶促反应速度一般在规定的反应条件 下，用单位时间内底物的消耗量和产 物的生成量来表示 III. 反应速度取其初速度，即底物的消耗 量很小（一般在5﹪以内）时的反应速 度 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应 IV. 底物浓度远远大于酶浓度
2．半动态法

于不同时间分别从反应体系中取出一定量的样
品，迅速置于反应终止液中，然后通过检测并
计算反应后不同时间样品中的底物减少量 (或
产物增加量)，从而计算出反应速度。
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本实验中的时间点间隔根据实验确定。
一般是酶活性高，时间间隔短；酶活性低，间隔可适当延长。
选用的时间点一般以3～5点为宜
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3．动态法 该法连续监测酶反应进行的程度，同时记录不 同时间点产物生成(或底物减少)量，然后计算 出单位时间内产物的增加(或底物的减少)量即 酶活力，再计算出其比活力。
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4. 偶联酶法
许多反应的底物或产物不能直接被检测
两种方法解决：
①在反应终止后，加入一种新的物质，其可以和产物 (或底物)反应，．生成可被检测的物质(如有颜色的物 质、荧光物质等)而间接测出产物(底物)的改变量 ②可将第一步酶反应的产物作为第二步酶反应的底物， 通过第二步酶反应生成可检测的产物，通过检测第二 步反应产物的变化计算出第一步底物(或产物)的改变 量，从而计算出催化第一步反应的酶活力
最适温度
酶 活 性
2.0
1.5
1.0
(optimum temperature)：
0.5
酶促反应速度最快时的 环境温度。
* 低温的应用
0
10 20 30 40 50 60
温度 º C
温度对淀粉酶活性的影响
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四、 pH对反应速度的影响
酶
活 性
胃蛋白酶
淀粉酶
胆碱酯酶
最适pH
(optimum pH)：