肥胖人群肠道菌群多样性研究

肥胖人群肠道菌群多样性研究作者：王洋周礼红

来源：《贵州大学学报（自然科学版）》2018年第04期

摘要：为了探讨肥胖人群肠道菌群多样性变化特征，招募34位志愿者，依照体重指数（中国标准）将志愿者分为四组，肥胖组、超重组、正常组、偏瘦组。获取志愿者新鲜粪便，提取肠道菌群总DNA。采用Illumina Miseq高通量测序平台，对粪便样本中所有细菌的16S rRNA V4-V5区进行DNA测序，对测序结果进行数据分析。结果发现，超重组的Chao指数显著低于正常组，Shannon指数显著低于偏瘦组，显示超重组的肠道菌群丰富度与多样性最低，正常组的肠道菌群丰富度最高，偏瘦组的肠道菌群多样性最佳;根据主成分分析与柱坐标分析发现，肥胖组的肠道菌群组成与其他三组差异较大，并且肥胖组内各样本距离较远，显示其组成也具有较大差异，提示肥胖人群的肠道微生物菌群构成不止一种模式。

关键词：肥胖;肠道菌群;多样性

中图分类号：Q939.93

文献标识码：A

文章编号;1000-5269（2018）04-0047-07

世界卫生组织（World Health Organization， WHO）最新数据显示，2016年全球成年人超重比例达到39%，肥胖比例高达13%[1]，而中国肥胖人口数量位居世界首位，男性肥胖人数为4320万，女性肥胖人数为4640万[2]。作为一种受遗传因素、环境因素、行为习惯相互作用的复杂疾病，肠道菌群在肥胖发生、发展过程中发挥重要作用。

人体微生物已达到1014个，是人体细胞数目的10倍，而寄存于胃肠道的肠道菌群中，厌氧性细菌占据绝大多数[3]。肠道菌群是一个复杂动态的系统，它处于人体与环境沟通的第一线，它能够与人体互利共生，协同进化，参与宿主能量代谢、免疫应答、生物拮抗等生理活动，由于肠道菌群的代谢能力等同于肝脏，因此，肠道菌群被称为“第二基因组”，又被视作机体的额外器官[4]，在人体与环境的相互作用中起到重要角色。

近年来，针对肠道菌群与肥胖关联的研究显示，肥胖人群肠道菌群在多样性上与正常人群具有差异[5-6]。Tumbaugh等人在对肥胖与非肥胖的双胞胎的研究中发现肥胖患者的肠道菌群总体多样性较正常人群减少[7]，Zupancic等人也有类似的发现，还有研究发现肥胖患者中厚壁菌门与拟杆菌门的比例显著下降[8]，另一项关于学龄前儿童肥胖的研究显示，超重或肥胖的儿童肠道菌群多样性减少，但并没有达到显著性差异[9]。新疆大学对于哈萨克族肥胖儿童的研究显示，肥胖儿童肠道菌群多样性减少[10]。

研究肥胖人群肠道菌群多样性与组成情况，探索肥胖与肠道菌群的关联，能够为研究肥胖发病的机制提供进一步佐证，并为治疗策略的制定和干预后的评估提供参考。

1;材料与方法

1.1;研究对象

1.1.1;来源

所有的研究对象均来自于招募的志愿者，所有志愿者对本实验的内容与性质均有明确认知，并且签署知情同意书，健康信息问卷调查和粪便样本采集均得到本人同意。

1.1.2;纳入与排除标准

纳入本实验的志愿者均为身体健康，无肢体缺陷与精神类疾病;所有志愿者均排除患腹泻、胃肠炎、克罗恩病等肠道疾病、内分泌及代谢性疾病;心、肝、肾等主要脏器无异常;至少一个月内没有使用过广谱抗生素、抗腹泻药物等药物。

1.1.3;样本分组标准

以BMI（Body Mass Index，体质指数=体重（kg）÷身高2（m））中国标准为划分依据，共分为4组，规定BMI数值（kg/m2）分组为：

肥胖组（Group1）≥28

24≤超重组（Group2）<28

18.5≤正常组（Group3）<24

偏瘦组（Group4）<18.5

1.1.4;志愿者基本信息

招募到34位志愿者，依據BMI数值分为4组：肥胖组Group1：4人;超重组Group2：9人;正常组Group3：18人;偏瘦组Group4：3人。

1.2;研究方法

1.2.1;样本采集

事先对所有研究人员进行相关试验培训，严控样本的采集时间与方法。使用采样器采集粪便样本，做好标记冻存于-80 ℃。所有样本在进行后期的检测分析前均保持在-80 ℃冻存。

1.2.2;样本总DNA提取

采用 QIAamp DNA Stool Mini Kit 试剂盒提取粪便总DNA。

1.2.3;宏基因组16s rDNA扩增

根据 illumina Miseq高通量测序要求，进行双向测序，设计目标区域和带有“5’Miseq接头-barcode-测序引物-特异引物-3’”的融合引物。并采用两步PCR扩增的方法构建文库。

引物序列：

F;5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA

CAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCT

CTTCCGATCT-特异引物-3′

R;5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT

- barcode -GTGACTGGAGTTCCTTGGC

ACCCGAGAATTCCA-特异引物-3′

对于细菌16S V4-V5区，特异引物序列采用：

515F 5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′

926R 5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′

PCR扩增：文库构建采用两步PCR扩增的方法，首先采用特异引物（下面描述为内侧引物）扩增目的片段，将目的片段进行胶回收，而后将回收产物作为模板进行二次PCR扩增（下面描述为外侧引物进行扩增），目的是将 illumina平台测序所需的接头，测序引物，barcode添加到目的片段的两端。根据实验需求，设计引物如下：

F内侧引物：5′-TTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特异引物-3′

F外侧引物：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCTC-3′

R内侧引物：5′-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-特异引物-3′

R外侧引物：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3′

第一次PCR扩增

PCR扩增体系：5xBuffer 10 μL，dNTP （10 mM）1 μL;Phusion超保真DNA聚合酶

1U;F/R内侧引物（10 μM）各1 μL;模版 5 ng～50 ng;ddH2O 补至50 μL。

PCR扩增程序：1、94 ℃ 2 min;2、94 ℃30 s;3、56 ℃ 30 s;4、72 ℃ 30 s;5、72 ℃ 5 min;6、10 ℃保温。2、3、4三步23个循环。

第二次PCR扩增

PCR扩增体系：5xBuffer 8 μL，dNTP （10 mM）1 μL;Phusion超保真DNA聚合酶 0.8 U;F/R内侧引物（10 ;μM）各1 μL;模版5 μL;ddH2O 补至40 μL。

PCR扩增程序：1、94 ℃ 2 min;2、94 ℃ 30 s;3、56 ℃ 30 s;4、72 ℃ 30 s;5、72 ℃ 5 min;6、10 ℃保溫。2、3、4三步8个循环。