染色体微阵列的原理与临床应用
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✓ First-generation-Sanger method ✓ Novel sequencing techniques
传统核型分析技术
除了染色体非整倍体，染色体微缺失和微重复等基因组失衡是导致胎儿发 育迟缓、畸形和其他先天性疾病的主要原因。
Structural variation in the human genome and its role in disease[J]. Annu Rev Med. 2010,61:437-55
出生缺陷
出生缺陷
遗传因素
染色体异常（所有新生儿中，染色 体异常占0.92%，多为新发而非遗 传）
单基因突变（多为孟德尔遗传，少 数为新发）
环境因素（理、化、生物因素、生活方式）
遗传+环境因素
基因组：细胞核DNA成分和线粒体DNA分子的总和 基 因: 基因组内一个个具体的结构和功能单位 染色体：基因的载体
longevity
More than 150 genes prevents cholesterol buildup
❖ 精确控制胚胎发育和分化的每一个步骤; ❖ 决定了个体的所有生命特征; ❖ 决定了个体患各种疾病的可能性.
➢遗传病：遗传物质发生突变所引起的疾病。 ➢种类：确定的遗传疾病超过7000种。 1、单基因病--涉及一对基因，AR、AD、XR、XD、Y连 锁遗传病。隐性遗传4000，显性遗传3000。 2、多基因病--多对基因和环境共同作用所导致的疾病。 3、染色体病--数目异常及结构异常引起的疾病。 4、体细胞遗传病--体细胞突变如肿瘤。 5、线粒体病--线粒体功能异常为主要起因的一大类疾病。 ➢特征：垂直传递、终生性、发病率低、危害严重、家族性 发病、多无有效治疗。成为危害人类健康的主要疾病。
传统核型分析技术
是目前较为成熟的遗传性疾病诊断技术
染色体数量变化、平衡、不平衡易位、转位和显微镜下 可见的大片段缺失和重复。
绒毛活检取材
孕中期羊膜腔穿刺羊水 细胞培养
染色体核型分析
核型分析局限性
➢ 材料受限，需要新鲜的组织、血样进行活细胞培养 ➢ 不能分辨长度在10Mb以下染色体片断的缺失、重复或易位 ➢ 染色体亚端粒区域异常诊断率较低 ➢ 不能检测LOH和UPD
金域检验（2013-2016）：4750例，26.3%
截止2016年5月，金域检验已采用CMA检测出生缺 陷/遗传病病例4750例，其中阳性病例1249例，检 出阳性率达26.3%
患者临床表型 智力低下、发育迟缓、多发畸形、自闭症
患者临床表型解析
临床表型
智力低下 发育迟缓 多发畸形
染色体芯片与传统细胞遗传学技术比较
检测范围
CMA基因芯片
染色体核型分析
FISH
整套染色体数目异常和微缺失、整套染色体数目异常，大片段 靶向检测
微重复结构异常
缺失、重复，平衡及不平衡易
位，倒位
细胞培养 不需要
单亲二倍体 Yes
近亲结婚 Yes
分辨率 嵌合体
30Kb Yes
需要 No No 5-10Mb Yes
单细胞分析
高分辨率分析
荧光原位杂交技术（fluorescent in-situ hybridization，FISH)
➢ 可对相应位点的缺失、重复、易位及多倍体等染色体异常作出诊断 ➢ 提高了染色体异常的诊断精度 ➢ FISH探针能同时与分裂期染色体或间期核染色丝特异杂交----无需细
胞培养，可用于单细胞分析
染色体微阵列技术原理 与临床应用
金域医学检验中心 袁海明
一.出生缺陷概念及概况 二.遗传病常见诊断方法及比较 三.染色体微阵列技术临床应用 四.病例分享 五.染色体微阵列技术局限性、结果 判读及带来的挑战
一.出生缺陷概念及概况
出生缺陷
➢也称先天异常，是指由于遗传因素、环境因素或两者 共同作用于孕前或孕期，引起胚胎或胎儿在发育过程中 发生解剖学结构和/或功能上的异常。 ➢2012年卫生部统计我国出生缺陷率达5.6%，每年新增 出生缺陷患儿90-120万例。 ➢随着二胎政策的全面放开，孕妇年龄增加及环境因素 影响，估计出生缺陷数量还会增加。 ➢保守估计，我国有上千万的罕见病群体，几乎无法得 到有效诊断和治疗，甚至遭到严重歧视。
Chromosome 13q13-14
Chromosome 21q21
荧光标记的DNA探针
中期分裂相
间期细胞核
FISH局限性
➢ 只能检测已知突变的疾病，对背景未知的基因引发的疾病无法检测。 ➢ 不能分辨LOH和UPD ➢ 一次最多只能检测5-8个位点，无法进行整个基因组的检测，增加探
针又会面临准确性下降的问题。 ➢ 对植入前胚胎的检测，缺乏覆盖全基因组检测的能力
孕前诊断-----植入前遗传学诊断技术
(preimplantation Genetic Diagnosis, PGD)
对植入前胚胎或卵裂球作染色体和/或基因学检测，将无疾病胚胎植 入子宫妊娠，并出生正常子代的技术
辅助生殖与遗传学技术相结合的一种产前诊断方法
关键点是建立单细胞遗传诊断技术
三、染色体微阵列技术 临床应用
精子 出生缺陷干预----关注生殖全程
+ 胚胎
胎儿
新生儿、儿童
卵子 孕前诊断 产前诊断 产后先天性疾病诊断
染色体异常
早期诊断 早期干预 改善预后
Βιβλιοθήκη Baidu
夫妻双方检测
正常
致病片段携带
再次生育再发风险低 再次生育再发风险高
染色体微阵列技术临床应用
➢植入前遗传病筛查和植入前遗传病诊断(PGD/PGS) ➢产前诊断 ➢产后遗传病诊断 ➢反复习惯性自然流产病因分析
SNP array
SNP芯片含有大量寡核苷酸探针，起初设计被用于检测 SNP等位基因。 SNP芯片不仅能够研究拷贝数变异（CNV），而且还 能够对SNP基因型进行分析
染色体微阵列(chromosomal microarray analysis,CMA)技术优势
全基因组范围内同时检测染色体数目异常和结构异常如染色体微缺失 (deletion)和微重复(duplication)，并能较准确的测定其大小，并精确定位。 不需要细胞培养，可直接检测血液、羊水(amniotic fluid, AF)和绒毛膜绒毛 (chorionic villus sampling, CVS) 样本，出报告速度更快，结果更加准确可靠。 检测≥10%水平的嵌合体 鉴定杂合子缺失LOH和单亲二倍体(uniparental disomy ，UPD)，亲缘关系的 分析。 分辨率高：30Kb 结合全基因扩增技术，可以进行胚胎全染色体组的检测------PGS/PGD
aCGH技术图示：正常对照样品和患者样品基因组DNA用两种不同的荧光染料进 行标记（正常样品用Cy3标记呈现绿色，患者样品用Cy5标记呈现红色）。绿色 峰（Cy3）表明红色信号缺失，与对照样品相比患者DNA样品发生缺失。相反如 果Cy5信号增强显示为红色峰（红色箭头），表明患者DNA样品特定基因组区域 发生获得。aCGH芯片能够定位DNA拷贝数量变化在基因组的位置。
染色体微阵列技术（chromosomal microarray analysis）
➢微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization, aCGH) ➢SNP array
微阵列比较基因组杂交技术
(array comparative genomic hybridization, aCGH)
1. 用于检测CNV的染色体芯片（CMA)在 下列情况应作为一线检测手段 ❖ 非已知综合症的多发畸形 ❖ 非综合症型的发育迟缓/智力低下 ❖ 孤独症谱系疾病
2. 进一步明确发育迟缓、语言发育落后和 其他尚不明确遗传学病因的症状
3. 对于一些CMA检出不平衡的病例，建议 用细胞遗传/FISH进行确认，同时对父 母进行临床遗传评估和咨询
➢ Monogenic disorders ❖Dominant (4,000) ❖Recessive (3,000)
➢ Multigenic disorders ❖Genes + Environments
二.遗传病常见诊断方法及比较
遗传病的诊断
➢染色体核型分析Karyotyping ➢ 荧光原位杂交 Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) ➢ 染色体微阵列技术Chromosomal microarray analysis (CMA) ➢ 测序技术
自身局限性：
•不能检测染色体平衡易位(相互易位、罗伯逊易位、倒位、平衡插入） •不能检测点突变及串联重复序列扩增导致的遗传病(如脆性X染色体综合征） •不能检测到低于本平台检测下限的基因组不平衡现象 •不能检测三倍体以上的多倍体 •会检测出临床意义不明拷贝数变异(copy number variants, CNVs)。
CMA植入前胚胎遗传学筛查/诊断适应人群
高龄产妇 反复体外受精失败 反复流产 严重的男性不育症 父母为平衡易位、倒位携带者 非整倍体是辅助生殖低妊娠率和高流产率的 主要因素，PGS的目的是识别整倍体的正常 胚胎转移，以实现增加怀孕的机会
1 in 10 couples
产前诊断
CMA产前诊断适应人群
父母为平衡易位携带者
胎儿B超检查发现异常
羊水染色体核型分析已发现异常，但无法确定异常染色体的确切位置或 来源
胎儿发现新发的染色体相互易位，需进一步排除微缺失和微重复
希望更全面、更准确的了解胎儿染色体情况，以排除出生缺陷的可能性 （生长发育迟缓，智力低下、自闭症等原因）
产前诊断
产后出生缺陷患儿遗传病诊断
Genetic/Genomic Disorders
➢Genomic disorders (number) ❖Trisomy 21 ❖Trisomy 18 ❖Trisomy 13 ❖Mosaic trisomies of other chromosomes
➢Genomic disorders (structure) ❖More than 400 known disorders
产后出生缺陷患儿遗传病诊断
The American Journal of Human Genetics 86, 749–764, May 14, 2010
21698例不明原因发育迟缓、低智，孤独症，多发畸形 芯片（CMA)检测：诊断率15%-20% 核型分析：诊断率仅3%
发育障碍和智力低下等先天缺陷疾病首选CMA
自闭症 癫痫 两个系统的异常 三个或以上系统的异常
拷贝数变异(copy number variants, CNVs)：
指大于1 kb染色体变异(基因组变异)，包括核型分析 检测不到的基因组微缺失和微重复，被发现广泛存在于人 类基因组中。已有大量研究证实CNVs与许多疾病相关， 包括数百种染色体微缺失、微重复综合征，是先天畸形和 神经发育障碍的主要遗传病因，包括智力低下(mental retardation, MR)，自闭症 (autism), 精神分裂症 (Schizophrenia)等。
两者均可 No No 100Kb Yes
染色体微缺失和微重复综合征
概念：染色体微阵列技术（chromosomal microarray analysis ，CMA）和荧光原位杂交技术（florescence in situ hybridization， FISH）的应用，使许多用传统染色体核型分 析难以识别的染色体综合征得以发现。
➢细胞核DNA: 46条染色体，30亿个碱基，编码21000个 基因。 ➢线粒体DNA: 双链闭合环状分子，16569个碱基，编码 37个基因，编码2种rRNA、22种tRNA和13种氧化磷酸 化相关蛋白。
Progeria syndrome
A point mutation of the LMNA gene
这些综合征缺失和重复的大小多在几百Kb到几兆碱基对。 与单基因病不同，其症状受多基因影响，因而又称连续性 基因缺失或重复综合征(contiguous gene deletion or duplication syndrome）。大部分综合征不能被染色体核型分 析所识别，因而成为微缺失和微重复综合征(microdeletion and microduplication syndrome）。
传统核型分析技术
除了染色体非整倍体，染色体微缺失和微重复等基因组失衡是导致胎儿发 育迟缓、畸形和其他先天性疾病的主要原因。
Structural variation in the human genome and its role in disease[J]. Annu Rev Med. 2010,61:437-55
出生缺陷
出生缺陷
遗传因素
染色体异常（所有新生儿中，染色 体异常占0.92%，多为新发而非遗 传）
单基因突变（多为孟德尔遗传，少 数为新发）
环境因素（理、化、生物因素、生活方式）
遗传+环境因素
基因组：细胞核DNA成分和线粒体DNA分子的总和 基 因: 基因组内一个个具体的结构和功能单位 染色体：基因的载体
longevity
More than 150 genes prevents cholesterol buildup
❖ 精确控制胚胎发育和分化的每一个步骤; ❖ 决定了个体的所有生命特征; ❖ 决定了个体患各种疾病的可能性.
➢遗传病：遗传物质发生突变所引起的疾病。 ➢种类：确定的遗传疾病超过7000种。 1、单基因病--涉及一对基因，AR、AD、XR、XD、Y连 锁遗传病。隐性遗传4000，显性遗传3000。 2、多基因病--多对基因和环境共同作用所导致的疾病。 3、染色体病--数目异常及结构异常引起的疾病。 4、体细胞遗传病--体细胞突变如肿瘤。 5、线粒体病--线粒体功能异常为主要起因的一大类疾病。 ➢特征：垂直传递、终生性、发病率低、危害严重、家族性 发病、多无有效治疗。成为危害人类健康的主要疾病。
传统核型分析技术
是目前较为成熟的遗传性疾病诊断技术
染色体数量变化、平衡、不平衡易位、转位和显微镜下 可见的大片段缺失和重复。
绒毛活检取材
孕中期羊膜腔穿刺羊水 细胞培养
染色体核型分析
核型分析局限性
➢ 材料受限，需要新鲜的组织、血样进行活细胞培养 ➢ 不能分辨长度在10Mb以下染色体片断的缺失、重复或易位 ➢ 染色体亚端粒区域异常诊断率较低 ➢ 不能检测LOH和UPD
金域检验（2013-2016）：4750例，26.3%
截止2016年5月，金域检验已采用CMA检测出生缺 陷/遗传病病例4750例，其中阳性病例1249例，检 出阳性率达26.3%
患者临床表型 智力低下、发育迟缓、多发畸形、自闭症
患者临床表型解析
临床表型
智力低下 发育迟缓 多发畸形
染色体芯片与传统细胞遗传学技术比较
检测范围
CMA基因芯片
染色体核型分析
FISH
整套染色体数目异常和微缺失、整套染色体数目异常，大片段 靶向检测
微重复结构异常
缺失、重复，平衡及不平衡易
位，倒位
细胞培养 不需要
单亲二倍体 Yes
近亲结婚 Yes
分辨率 嵌合体
30Kb Yes
需要 No No 5-10Mb Yes
单细胞分析
高分辨率分析
荧光原位杂交技术（fluorescent in-situ hybridization，FISH)
➢ 可对相应位点的缺失、重复、易位及多倍体等染色体异常作出诊断 ➢ 提高了染色体异常的诊断精度 ➢ FISH探针能同时与分裂期染色体或间期核染色丝特异杂交----无需细
胞培养，可用于单细胞分析
染色体微阵列技术原理 与临床应用
金域医学检验中心 袁海明
一.出生缺陷概念及概况 二.遗传病常见诊断方法及比较 三.染色体微阵列技术临床应用 四.病例分享 五.染色体微阵列技术局限性、结果 判读及带来的挑战
一.出生缺陷概念及概况
出生缺陷
➢也称先天异常，是指由于遗传因素、环境因素或两者 共同作用于孕前或孕期，引起胚胎或胎儿在发育过程中 发生解剖学结构和/或功能上的异常。 ➢2012年卫生部统计我国出生缺陷率达5.6%，每年新增 出生缺陷患儿90-120万例。 ➢随着二胎政策的全面放开，孕妇年龄增加及环境因素 影响，估计出生缺陷数量还会增加。 ➢保守估计，我国有上千万的罕见病群体，几乎无法得 到有效诊断和治疗，甚至遭到严重歧视。
Chromosome 13q13-14
Chromosome 21q21
荧光标记的DNA探针
中期分裂相
间期细胞核
FISH局限性
➢ 只能检测已知突变的疾病，对背景未知的基因引发的疾病无法检测。 ➢ 不能分辨LOH和UPD ➢ 一次最多只能检测5-8个位点，无法进行整个基因组的检测，增加探
针又会面临准确性下降的问题。 ➢ 对植入前胚胎的检测，缺乏覆盖全基因组检测的能力
孕前诊断-----植入前遗传学诊断技术
(preimplantation Genetic Diagnosis, PGD)
对植入前胚胎或卵裂球作染色体和/或基因学检测，将无疾病胚胎植 入子宫妊娠，并出生正常子代的技术
辅助生殖与遗传学技术相结合的一种产前诊断方法
关键点是建立单细胞遗传诊断技术
三、染色体微阵列技术 临床应用
精子 出生缺陷干预----关注生殖全程
+ 胚胎
胎儿
新生儿、儿童
卵子 孕前诊断 产前诊断 产后先天性疾病诊断
染色体异常
早期诊断 早期干预 改善预后
Βιβλιοθήκη Baidu
夫妻双方检测
正常
致病片段携带
再次生育再发风险低 再次生育再发风险高
染色体微阵列技术临床应用
➢植入前遗传病筛查和植入前遗传病诊断(PGD/PGS) ➢产前诊断 ➢产后遗传病诊断 ➢反复习惯性自然流产病因分析
SNP array
SNP芯片含有大量寡核苷酸探针，起初设计被用于检测 SNP等位基因。 SNP芯片不仅能够研究拷贝数变异（CNV），而且还 能够对SNP基因型进行分析
染色体微阵列(chromosomal microarray analysis,CMA)技术优势
全基因组范围内同时检测染色体数目异常和结构异常如染色体微缺失 (deletion)和微重复(duplication)，并能较准确的测定其大小，并精确定位。 不需要细胞培养，可直接检测血液、羊水(amniotic fluid, AF)和绒毛膜绒毛 (chorionic villus sampling, CVS) 样本，出报告速度更快，结果更加准确可靠。 检测≥10%水平的嵌合体 鉴定杂合子缺失LOH和单亲二倍体(uniparental disomy ，UPD)，亲缘关系的 分析。 分辨率高：30Kb 结合全基因扩增技术，可以进行胚胎全染色体组的检测------PGS/PGD
aCGH技术图示：正常对照样品和患者样品基因组DNA用两种不同的荧光染料进 行标记（正常样品用Cy3标记呈现绿色，患者样品用Cy5标记呈现红色）。绿色 峰（Cy3）表明红色信号缺失，与对照样品相比患者DNA样品发生缺失。相反如 果Cy5信号增强显示为红色峰（红色箭头），表明患者DNA样品特定基因组区域 发生获得。aCGH芯片能够定位DNA拷贝数量变化在基因组的位置。
染色体微阵列技术（chromosomal microarray analysis）
➢微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization, aCGH) ➢SNP array
微阵列比较基因组杂交技术
(array comparative genomic hybridization, aCGH)
1. 用于检测CNV的染色体芯片（CMA)在 下列情况应作为一线检测手段 ❖ 非已知综合症的多发畸形 ❖ 非综合症型的发育迟缓/智力低下 ❖ 孤独症谱系疾病
2. 进一步明确发育迟缓、语言发育落后和 其他尚不明确遗传学病因的症状
3. 对于一些CMA检出不平衡的病例，建议 用细胞遗传/FISH进行确认，同时对父 母进行临床遗传评估和咨询
➢ Monogenic disorders ❖Dominant (4,000) ❖Recessive (3,000)
➢ Multigenic disorders ❖Genes + Environments
二.遗传病常见诊断方法及比较
遗传病的诊断
➢染色体核型分析Karyotyping ➢ 荧光原位杂交 Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) ➢ 染色体微阵列技术Chromosomal microarray analysis (CMA) ➢ 测序技术
自身局限性：
•不能检测染色体平衡易位(相互易位、罗伯逊易位、倒位、平衡插入） •不能检测点突变及串联重复序列扩增导致的遗传病(如脆性X染色体综合征） •不能检测到低于本平台检测下限的基因组不平衡现象 •不能检测三倍体以上的多倍体 •会检测出临床意义不明拷贝数变异(copy number variants, CNVs)。
CMA植入前胚胎遗传学筛查/诊断适应人群
高龄产妇 反复体外受精失败 反复流产 严重的男性不育症 父母为平衡易位、倒位携带者 非整倍体是辅助生殖低妊娠率和高流产率的 主要因素，PGS的目的是识别整倍体的正常 胚胎转移，以实现增加怀孕的机会
1 in 10 couples
产前诊断
CMA产前诊断适应人群
父母为平衡易位携带者
胎儿B超检查发现异常
羊水染色体核型分析已发现异常，但无法确定异常染色体的确切位置或 来源
胎儿发现新发的染色体相互易位，需进一步排除微缺失和微重复
希望更全面、更准确的了解胎儿染色体情况，以排除出生缺陷的可能性 （生长发育迟缓，智力低下、自闭症等原因）
产前诊断
产后出生缺陷患儿遗传病诊断
Genetic/Genomic Disorders
➢Genomic disorders (number) ❖Trisomy 21 ❖Trisomy 18 ❖Trisomy 13 ❖Mosaic trisomies of other chromosomes
➢Genomic disorders (structure) ❖More than 400 known disorders
产后出生缺陷患儿遗传病诊断
The American Journal of Human Genetics 86, 749–764, May 14, 2010
21698例不明原因发育迟缓、低智，孤独症，多发畸形 芯片（CMA)检测：诊断率15%-20% 核型分析：诊断率仅3%
发育障碍和智力低下等先天缺陷疾病首选CMA
自闭症 癫痫 两个系统的异常 三个或以上系统的异常
拷贝数变异(copy number variants, CNVs)：
指大于1 kb染色体变异(基因组变异)，包括核型分析 检测不到的基因组微缺失和微重复，被发现广泛存在于人 类基因组中。已有大量研究证实CNVs与许多疾病相关， 包括数百种染色体微缺失、微重复综合征，是先天畸形和 神经发育障碍的主要遗传病因，包括智力低下(mental retardation, MR)，自闭症 (autism), 精神分裂症 (Schizophrenia)等。
两者均可 No No 100Kb Yes
染色体微缺失和微重复综合征
概念：染色体微阵列技术（chromosomal microarray analysis ，CMA）和荧光原位杂交技术（florescence in situ hybridization， FISH）的应用，使许多用传统染色体核型分 析难以识别的染色体综合征得以发现。
➢细胞核DNA: 46条染色体，30亿个碱基，编码21000个 基因。 ➢线粒体DNA: 双链闭合环状分子，16569个碱基，编码 37个基因，编码2种rRNA、22种tRNA和13种氧化磷酸 化相关蛋白。
Progeria syndrome
A point mutation of the LMNA gene
这些综合征缺失和重复的大小多在几百Kb到几兆碱基对。 与单基因病不同，其症状受多基因影响，因而又称连续性 基因缺失或重复综合征(contiguous gene deletion or duplication syndrome）。大部分综合征不能被染色体核型分 析所识别，因而成为微缺失和微重复综合征(microdeletion and microduplication syndrome）。