基因工程抗体

改变抗体分子大小增强靶向性
抗体分子大小、与抗原结合价数直接影响 抗体的穿透性、廓清率及在血液和靶部位 的比例。
用分子生物学手段可以获得完整抗体和各 种抗体片段
改变抗体分子大小增强靶向性
抗体分子越小越容易通过血管壁，但 在血液中被清除的速度也快。完整抗 体穿透性差，但在血液中的半衰期长， 可达几十个小时。
鼠源单抗临床应用的障碍
血清半衰期短 分子量大，达靶部位量不足 自身效应功能不强 人抗小鼠抗体（HAMA）
human anti-mouse antibody
HAMA反应的示意图
影响单抗与靶细胞或抗原结合 引起变态反应和器官损害
基因工程抗体
基因工程抗体（genetic engineering antibody） 根据不同的目的和需要，利用DNA重组技术或蛋白质
预变性
94oC5’
模板DNA dNTP 引物 Buffer
PCR技术的基本过程
循 94℃ 环 55 ℃ 仪 72 ℃
RT-PCR反应原理
逆转录酶 mRNA为模
板合成 cDNA cDNA为模 板进行PCR 反应
引物的设计
参考Kabat数据库中免疫球蛋白的序列设 计引物。
5´末端：第一骨架区或引导肽序列 3´末端：保守的恒定区或J链区
－ 提供研究分子功能方法 － 基因治疗：在细胞内抑制病毒复制和抑制生长因 子受体或癌细胞表达 － HIV-1、抗肿瘤
基因工程抗体的优点
通过基因工程技术的改造，可以最大程度降低抗 体的鼠源性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反 应。
基因工程抗体的分子较小，穿透力强，更易到达 病灶的核心部位。
可以根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体。 可以采用原核细胞、真核细胞或植物等多种表达
噬菌体展示技术的发展
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
RNA
DNA
cDNA
PCR
L、H library
E.coli表达
筛选
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
噬菌体抗体库
利用噬菌体表面展示技术将抗体基 因与丝状噬菌体外壳蛋白基因融合，使 抗体片段表达于噬菌体表面，构建成噬 菌体抗体库，用抗原筛选出表达相应抗 体的噬菌体克隆，经扩增可获得大量抗 体。
引物设计的注意事项
简并性的使用
简并引物（degenerate primers）是 指碱基序列不同，但有相同碱基数的一 组针对某一基因相同区域的寡核苷酸混 合物。
由于充分考虑了密码的简并性，在这种 混合引物中必定有一种引物可以和该基 因的DNA序列精确互补。
引物设计的注意事项
为便于PCR产物的克隆，引物的末端 一般应包含有一个内切酶位点，为保证 酶切的消化效率，常在内切酶位点的外 侧加上若干个保护碱基。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)
体外扩增特异DNA片段的技术。PCR技术的特异性 取决于引物和模板DNA结合的特异性。 反应分三步：① 变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸 （ex tension）。
TaqDNA聚合酶
模板DNA dNTP 引物 Buffer
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
人－鼠嵌合抗体
抗CD20抗体 Rituximab
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
改型抗体－CDR移植抗体
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
表面氨基酸残基“人源化”技术
－ 计算机建模技术、蛋白质晶体结构数据 －不同种属间免疫球蛋白的同源性极高，尽管属 于不同类型，其CDR长度也不一致，但暴露于表 面的氨基酸残基的位置和数量相对保守。 －表面残基的组成模式在种系内保守，种系之间 互不相同，这种差异是免疫原性的来源。
工 程 改变抗体分子大小增强靶向性
改 造 增强抗体效应功能
的
抗
鼠单抗人源化
体
重组抗体的发展概况
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术 改变抗体分子大小增强靶向性 增强抗体效应功能
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
鼠抗体的人源化
嵌合抗体 改型抗体 表面重塑抗体
人源化抗体技术
抗体库技术 转人Ig基因小鼠技术
Fra Baidu bibliotek 鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
抗体库技术
用基因工程方法把人或其他动物的全 套抗体的轻、重链可变区基因克隆出来， 在原核载体上表达，然后筛选出所需的 特异基因和抗体。
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
抗体库技术形成的技术基础
PCR 一种引物扩增出全套免疫球 蛋白可变区基因
大肠杆菌直接表达有功能活性的抗体分 子片段
嵌合抗体的优缺点
优点
降低HAMA反应，延长半衰期，改善药代 动力学特性。
含人抗体Fc段，介导CDC及ADCC。
缺点
保留鼠抗体完整可变区，仍有一定抗原性。 导向诊断和治疗受限。
已批准上市的治疗性单抗
抗体名称 抗体种类 靶向抗原
适应症
批准日期
OKT3
鼠单抗
CD3
Panorex 鼠单抗
17-1A
小鼠Ig的基因结构
轻链和重链的重排
可 变 区 基 因 的 重 组
基因文库（gene library，gene bank）
限制性 内切酶
基因组DNA
……
克隆、转化、培养、鉴定
基因文库
分子杂交钓取目的基因
cDNA文库
mRNA 反转录酶
cDNA
基因重组
PCR技术
5’ 3’
5’
引物
引物
5’
基因组
同一抗体的两个抗原结合部分分别针对两个不同 的抗原，在结构上是双价的，而与抗原结合的功能 是单价的。
－可介导标记物与靶抗原的结合 －使某种效应分子定位于靶细胞 －可提高抗体的某些生物学效应 －减少抗体的体内非特异性分布
增强抗体效应功能
细胞内抗体（intrabody）
在抗体基因的N端或C端加入引导序列使抗体表达定 位在亚细胞部位，如胞质、线粒体、内质网或细胞核 部位。在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体称为 细胞内抗体或内抗体。
增强抗体效应功能
免疫细胞因子（immunocytokine）
将抗体与细胞因子连接后表达的融合蛋白。 －抗体的特异性＋细胞因子的有效免疫刺激活性 －能识别肿瘤细胞上的特异性抗原，避免对其他组 织细胞的伤害，通过细胞因子对免疫系统的激活，可 以控制肿瘤转移和杀灭残留病灶。
增强抗体效应功能
双特异性抗体
ReoPro 人-鼠嵌合Fab 血小板受体
ⅡbⅢa
Rituxan 人-鼠嵌合抗体 CD20
Simulect 人-鼠嵌合抗体 CD25
和特异性。 在人体内的半衰期明显延长。
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
克隆可变区基因的方法
用探针从该杂交瘤细胞系的基因组文库 中钓取；
用RT-PCR方法从该细胞的mRNA中扩 增VH及VL基因。
增强抗体效应功能
天然抗体细胞毒效应有限 调理作用 ADCC 依赖补体的细胞毒效应
增加抗体对靶细胞的杀伤 免疫结合物 免疫细胞因子 双特异性抗体 细胞内抗体
增强抗体效应功能
免疫结合物（immunoconjugate）
抗体或抗体片段为载体连接放射性核素、药 物或毒素构成。 Ab＋放射性核素 免疫显象或治疗 Ab＋药物 效应谱、毒性谱 Ab＋毒素 免疫毒素
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
抗 原 表 位 导 向 选 择
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
转基因小鼠制备人源抗体
灭活小鼠胚系Ig基因
敲除Ig基因组
将人胚系Ig基因转移到小鼠染色体
微基因位点胚胎细胞注射 人工染色体技术 微胞介导的染色体转移
重组抗体的发展概况
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术 改变抗体分子大小增强靶向性 增强抗体效应功能
基因工程抗体
基因工程抗体
Prof Sir Gregory Winter CBE FRS
单克隆抗体
抗血清
The rise of antibody-based therapeutics further illustrates the substantial change in the paradigms of pharmaceutical development, by utilizing the body's own capabilities as a source for a drug rather than the chemists reagents vessel. Source: Nature Biotechnology
以抗体在靶部位与血液中的比值（T/B）而言， diabody和minibody明显高于完整抗体和单链抗体。
T/B比值的增高意味着抗体在靶部位浓度高，靶向性好。 diabody和minibody是较理想的免疫显象或治疗用抗
体形式。
重组抗体的发展概况
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术 改变抗体分子大小增强靶向性 增强抗体效应功能
系统大量生产抗体分子，成本大大降低。
第一节 人-鼠嵌合抗体
人-鼠嵌合抗体 (Chimeric Antibodies)
人-鼠嵌合抗体 是通过基因工程将鼠 源单抗的可变区与人 抗体的恒定区连接起 来并在合适的宿主细 胞中表达而得到的抗 体。
人-鼠嵌合抗体的特点
含75～80%人抗体，20%鼠抗体。 恒定区是人源性的，大大降低了HAMA。 可有效激活CDC和ADCC。 可变区为鼠源，保留了亲本单抗的亲和力
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
宿主细胞的选择
骨髓瘤细胞
稳定表达
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞
非洲绿猴肾（COS）细胞 肿瘤浸润性T淋巴细胞
短暂表达
嵌合抗体的表达
二氢叶酸还原酶（dhrf）扩增系统
CHO的显性选择标记基因 转染阳性细胞筛选
甲氨喋呤 dhfr基因扩增 抗体基因扩增 抗体表达量提高
噬菌体抗体库技术
利用噬菌体抗体库，筛选并富集特异性抗 体的过程，称为噬菌体抗体库技术。
特点：基因型和表型相统一、选择能力和 扩增能力相结合。
抗体库的富集筛选
筛选流程
抗原
+
结合与洗涤
噬菌体抗体库
再循环
洗脱
放大
抗体库技术优点
扩大了筛选容量 106克隆 直接克隆抗体基因 抗体基因可进一步进行改造
PCR克隆VL和VH基因
合成单链cDNA
回收PCR产物，克隆到T-载体
PCR、测序鉴定抗体序列
转化大肠杆菌
抗体恒定区类型的选择
活化补体能力
IgM>IgG3>IgG1>IgG2
ADCC作用
IgG1>IgG3
与Fc受体结合能力
IgG1、IgG3 > IgG4、IgG2
ADCC＋CDC
IgG1
抗原结合功能
工程技术，在基因水平上对抗体分子进行加工、改造和 重组装配，然后导入受体细胞进行表达产生的抗体分子。 也称第三代抗体。
基因工程抗体原理 B细胞获得编码抗体的基因，或以PCR扩增抗体基因片
段，经体外DNA重组后，转化受体细胞，使其表达特 定抗体。
基因工程抗体的发展概况 小分子抗体
基 因 鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
强启动子
CMV、EF-1α
真核细胞选择性的mRNA翻译和翻译后加工信号
Kozak序列、翻译终止密码子、mRNA切割及加尾信号、 mRNA剪切信号
转录终止子 原核启动子和筛选标志 真核表达筛选标志
DHFR（二氢叶酸还原酶）、CS（谷氨酸合成酶）
表达载体的构建
适合在骨髓瘤细胞表达嵌合抗体轻、重链的载体示意图
为保证PCR产物的准确性，应尽量采 用引导肽部分的引物。
克隆可变区基因常用的引物
克隆鼠κ轻链可变区所用的部分引物
克隆鼠重链可变区所用的部分引物
克隆可变区基因的操作流程
杂交瘤细胞
单链cDNA分离
RNA提取试剂盒
H链引导肽引物 /恒定区引物
L链引导肽引物/ 恒定区引物
制备总RNA
第一链cDNA合成试剂 盒
鼠抗体的人源化及人源抗体制备技术
表面氨基酸残基“人源化”技术
－ 将鼠轻、重链可变区组成的Fv段表面暴露的骨 架区氨基酸残基中与人Fv不同者改为人抗体中的 氨基酸，使Fv的表面残基人源化。 － 消除免疫原性又不影响Fv的整体空间构象，从 而保留其抗原结合部位的结构。 － 抗CD3抗体 HuM291
IgG2、IgG4
人鼠嵌合抗体的构建
可变区基因的克隆 表达载体的构建 嵌合抗体的表达
表达系统的选择
大肠杆菌、噬菌体 无糖基化功能
酵母菌 Asn-X-Ser/Thr 糖基化错误
哺乳动物细胞表达系统 最常用的表达体系
表 达 载 体 的 构 建
共转染模式和单载体转染模式
真核表达载体的要求