酶法解析

测酶活力就是在确定的最适反应条件下 测定酶促反应速度，
酶促反应速度取决于那些因素 ？
——速度方程
测定酶活力的基本要求：
1、要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度 的唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）；
2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大 能力）；
所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下 几方面做工作：
表示酶制剂的纯度，比活力愈高，酶愈纯。
（二）测定方式有二：
❖ 1. 测定一定时间内的化学反应的量 通常测定在一定时间内最适于酶的条件下
酶促反应产物的生成量。 如蛋白酶的活力，可据酶催化酪蛋白水解
生成的酪氨酸与酚试剂作用蓝色反应，再用 比色法测定之。 ❖ 2. 测定完成一定量反应所需的时间，测定酶 所催化的一定量底物的减少或一定量产物的 生成所需的时间，酶活力与之成反比。
键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精 等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又 称为液化酶。 方法：终止法 热变性
测吸光度
第二节 酶法分析
在进行酶法分析时，先要根据分析
对象选择适它的“工具酶”，然后再通 过酶反应的测定，并借助相应的校正曲 线来检知它们的浓度或含量。在上述几 种检测对象中，除了底物可以采用总变 量分析法（终点法）外，其它都只能用 动力学分析法。
(2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物 反应的另一底物应具有足够高的浓度。
(3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到 终点。
（三）、酶法分析包括两个步骤：
1.酶反应 在适宜的条件下进行催化反应
2.检测 测定反应前后物质的变化情况，可以测 定底物的减少、产物的增加或辅酶的变 化
（四）酶法分析分类
常用于食品、药物、体液等样品中成分含 量检测如血糖、胆固醇等测定。
第一节、酶活力的测定
一、酶活力测定（一）基本定义
二、 酶活力
（一） 酶活力 酶活力activity： 酶催化一定化学反应 的能力。用酶催化的反应速度来表示酶 活力，即用单位时间内，单位体积中底 物的减少量或产物增加量来表示。
转换频率：单位时间转化的底物分子数。
终止其反应，再用wenku.baidu.com学或物理方法 测定产物或底物变化的量。
三 酶活力的测定方法
（二）动力学法 是连续测定酶反应过程中底物、
产物或辅酶的变化量，可以直接测 定酶促反应的初速度。
三 酶活力的测定方法
（三）酶偶联法 指选择另一种酶与酶发生偶联反应，
即物第，一通种过酶测E定1第所二催个化酶的促产反物应作产为物E2的的量底 变化来测的活力，此法适用于活力不高 或所催化产物不便测定的一些酶活力测 定。
（关键是工具酶的专一、高纯、且过量，以保证被测反应的v是总反
应系统中的限速因子，测得的指示反应速度 和E1浓度间呈线性关系）
举例：α-淀粉酶活力测定
1.标准碘液法 原理：淀粉对碘呈蓝黑色的特异性逐渐消失，
消失的速率与酶活性有关。 方法：终止法 稀盐酸
测吸光度 2.DNS法 α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷
1.单酶反应定量 使用单一酶与底物反应，然后测出物质
前后变化，确定底物的量。 2.偶联酶反应定量
利用两种或以上酶的联合作用，使底物通过 两步或多步反应，转化为易于检测的产物， 从而测定被测物质的量。
其它因素。
空白是指待测酶反应以外的其它反应（杂酶、 自发反应）引起的变化量
空白值可通过不加底物、不加酶、或两者都加 而预先使酶失效而测定
例如： GPT 测定中 —— 先不加底物；
酸性磷酸酯酶中 —— 先不加酶；
对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果， 与样品酶对照来定量。
三 酶活力的测定方法
（一）终止法 是使酶促反应进行一定时间后，
Kcat,单位1/s
（二）酶活力单位及比活力
酶活力单位U（active unit）：是根据 某种酶在最适条件下，单位时间内被酶 作用的底物的减少量或产物的生成量来 规定的，表示酶活力高低。
IU：umol/min Kat：mol/s
1 Kat=6×107 IU
酶的比活力 指每mg酶蛋白（或每mg 蛋白氨）所含的酶活力单位数即：比活 力=活力单位数/酶蛋白（氮）mg
以酶为分析对象，目的是检测食品、药物 体液等生物样品中酶的含量或活性；
如：血液中谷丙转氨酶、淀粉酶等测定；
葡萄糖氧化酶生产发酵液中葡萄糖氧化酶活 力测定等；
酶法分析（ENZYME ANALYSIS）
酶法分析是一种以酶为分析工具（分析试 剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶、 活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品 有关的样品中酶以外其他物质的含量。
E1
A
B
E2 C
被测反应的产物是某脱氢酶的底物,即B 是脱氢酶E2的底物,测定系统中加入足量的 脱氢酶E2和NADH,使反应进行到C,然后通过 NADH的特征变化而测知。
HK
被测反应： G + ATP
G-6-P + ADP
偶联指示反
G6PDH
应： G-6-P + NADP
NADPH + 6-PGCOOH
条件：
和酶活力测定的基本相同，但其所用 的酶量必须一定，除了相应的被测因素 的浓度应控制在限速水平以外，其它反 应成份均须保证处于恒定和最适。
应用时应考虑两个问题，即工具酶的用 量与反应的平衡点。
终点法要操作中应注意：
(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反 应于1级反应水平。因为这样可以使反应迅速 达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反 应；减少工具酶的用员。
底物？ pH？ 温度？ 样品？
二、测定中应注意的问题 1.初速度
底物浓度对酶速的影响
浓度选择：
a） [s]>=100Km； b） 有时不宜采用高底物浓度（有
毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等)则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。
作用于待测酶产物的其它酶； （如腈水合酶与酰胺酶）
第四章 酶分析法
酶分析法：
酶活力测定（酶研究的一部分） 酶法分析（酶作为分析的工具）
前者的目的在于检知样品中某种酶的 含量或活性，后者则主要用于测定与生 物学有关的样品中酶以外其它物质的含 量。两者检测对象不同，但原理基本一 致：酶的专一性、高效性，通过酶反应 速度测定物质的变化进行定量分析。
酶分析 （Enzyme Assay）