全长cDNA在功能基因组学中的意义

全长cDNA在功能基因组学中的意义

cDNA（complementary DNA）是指从mRNA反转录而得到的DNA，是mRNA的一个可靠的拷贝。由于cDNA已经经过了剪接，而且含有完整的CDS，因此cDNA是研究基因功能以及基因结构的重要资源。采用一般的方法构建的cDNA文库，其全长的比例往往比较低，主要是因为在cDNA第一链的生成过程中，反转录酶在还没有生成完整的第一链的情况下就脱离了反应，以致得到不完整的cDNA。CDNA第一链的生成一般使用polyT作引物，因此，一般cDNA文库中，含有大量的3’端EST，而mRNA5’端的信息较少。但在功能基因组的研究中，5’端序列更有意义。因此，构建富含全长的cDNA克隆的文库显得更加重要。

1富含全长cDNA的文库的构建

（sequence 全长cDNA就是含有完整的3’和5’端的cDNA，mRNA的3’端具有polyA作为“标签序列”

tag）用于辩别mRNA或cDNA是否含有完整的3’端。在生成第一链cDNA的过程中一般采用polyT 作引物，所以，得到的cDNA克隆一般都含有完整的3’端。mRNA的5’端与3’端不同，它没有高度保守的序列可用作“标签序列”来通过DNA/DNA或DNA/RNA杂交进行5’端鉴定，只有帽子结构（CAP）。因此为了分离到全长cDNA克隆，研究者一般利用“帽子结构”在mRNA的5’端加上一段序列或者其他标记物。

1．1．1 常规方法

这里说的常规方法，也就是够建一般的cDNA文库所采用的方法。分离出mRNA后，以mRNA为模板、带接头的polyT作引物合成第一链cDNA，再以用第一链作模板合成双链cDNA，加上5’端接头，便可连到载体上。

1．1．2 Oligo—CAP的方法

Oligo—CAP的方法是在mRNA的5’端加上一段寡核苷酸取代5’CAP。具体过程如图1所示。其原理是在BAP（bacterial alkaline phosphatase）和TAP（tobacco acid pyrophosphatase）的作用下，完整的mRNA（含CAP）的5’端的G被切除，剩下一个一个磷酸基团，可以在RNA连接酶的作用下与Oligo adapter连接；而不含CAP的mRNA的5’端则是一个羟基，无法与Oligo adapter连接。这样，mRNA的5’端也有了可识别的“标签序列”。

1．1．3 CAP—Select的方法

如图2所示，在生成cDNA第一链时，引物中带锚定序列，同时加入MnCl2。在MnCl2存在时，反转录酶会在有CAP的mRNA为模板的第一链cDNA的3’端加上三至四个dCMP，然后在末端转移酶的作用下加上三到四个dAMP，在3’端形成一粘端。这样，在RNA连接酶的作用下加上3’接头。这样，在5’和3’端都有特异的序列用于PCR扩增及全长cDNA的筛选。

1．1．4 CAP—Traper select的方法

主

图1 Oligo —Capping 法构建全长cDNA 文库

图2 CAP —SELECT 法获得全长cDNA

要过程如图3所示。它采用的策略就是cDNA第一链生成，DNA/RNA复合物未分离时，用生物素标记RNA的5’端，再用Rnase I处理。如果形成的第一链cDNA不完整，那在Rnase I的作用下，突出的单链RNA被降解，5’端的生物素标记也随之失去。生物素与磁珠偶联的亲和素吸附，这样，经过层析，便可把全长与非全长的cDNA分离开。

1．2 文库中全长cDNA的识别

以上介绍的几种方法可得到含有一定比例全长cDNA的文库。但并非所有的克隆都是全长cDNA克隆，因此还必须从文库中筛选出全长cDNA克隆。

1．2．1 序列测定

为了节约成本和时间，并不一开始便测出文库中的所有序列。通用的做法是，首先测定cDNA3’或5’端的序列。3’序列可知道是否含有polyA，而5’序列则可以用来推测全长的可能性。