酶的发酵生产
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2.1 酶生物合成的基本理论
• 2.1.1 RNA的生物合成——转录 • 2.1.2 蛋白质的生物合成——翻译 • 2.1.3 酶生物合成的调节
一、RNA的生物合成——转录
• 转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为 底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用 下，生成RNA的过程。
二、蛋白质的生物合成——翻译
lac 操纵子的正调控—分解代谢物阻遏
CAP---降解物基因活化蛋白
分解代谢物激活蛋白，cAMP受体蛋白
环腺苷酸受体蛋白CRP和CAP
细菌中cAMP的含量与葡萄糖的分解代谢有关。 当细菌利用葡萄糖为能源时，cAMP生成少而 分解多， cAMP含量低；当环境中无葡萄糖可 利用时， cAMP含量就升高。细菌细胞中含有 一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP （cyclic AMP receptor protein，CRP）。CRP 未与cAMP结合时是无活性的。当cAMP浓度 升高，与CRP结合并发生空间构象的变化而活 化， cAMP与CRP结合生成的复合物即为CAP。 以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。
翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物， 在核糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因 子的作用，合成多肽的过程。
四个阶段 1、氨基酸活化生成氨酰－tRNA 2、肽链合成的起始 3、肽链的延伸 4、肽链合成的终止
肽链的终止，释放和修饰
• 终止密码子 • 释放因子 • 肽链的修饰
三、酶生物合成的调节
打破酶合成调节限制的方法：
一、通过条件控制提高酶产量：
1. 添加诱导物 （1）酶作用的底物 （2）酶作用底物的前体物质 （3）酶的反应产物 （4）酶的底物类似物或底物的修饰物
2. 降低阻遏物浓度 3. 添加表面活性剂，促进分泌 4. 添加产酶促进剂
二、通过基因突变提高酶产量：
使诱导型变为组成型，使阻遏型变为去阻遏型
第二节 发酵工艺条件及控制
工艺流程
保藏细胞
原生质体
细胞活化 细胞扩大培养
固定化细胞
固定化原生质体
培养基
发酵
预培养 无菌空气
分离纯化
一、细胞活化与扩大培养
活化：使用以前，必须接种于新鲜的斜面培 养基上，在一定条件下进行培养，以恢复 细胞的生命活动能力。
扩大培养：增加发酵时的数量，经过一级至 数级扩大培养。培养基称为种子培养基。
操纵子模型（operon model)：是原核生物基
因表达的调节机制。大肠杆菌乳糖操纵子是第一个 被子发现的操纵子（Monod和Jacob，1961）
操纵子及调节基因示意图
酶合成调节的类型： 诱导和阻遏 1、酶合成的诱导 乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导a-淀粉酶的合成
①乳糖操纵子的结构
E.coli能利用乳糖作为碳源，而利用乳糖作为碳 源的酶只有当乳糖成为唯一碳源时才被合成。
滞后合成型： 只有当细胞生长进入稳定期后才开始 酶的合成并大量积累(图2-1)。
A
细胞浓度 B
酶浓度
酶浓度
细胞浓度
浓度
C
细胞浓度 D
酶浓度
酶浓度
细胞浓度
图2-1 酶生物合成模式
时间(h)
A.同步合成型; B.延续合成型; C.中期合成型; D.滞后合成型
影响酶生物合成模式的因素主要是mRNA和培养基中 存在的阻遏物： mRNA稳定性高的，可以在细胞停 止生长后继续合成相应的酶； mRNA稳定性差的， 随着细胞生长停止而终止酶的合成； 不受阻遏物阻 遏的,可随着细胞生长而开始酶的合成；受阻遏物阻 遏的,要在细胞生长一段时间或进入稳定期后解除阻 遏,才能开始酶的合成。
位点可被乳糖阻抑蛋白相结合。 lacI ，它是一个独立的调节基因，编码乳糖阻
抑蛋白。
乳糖操纵子模型
2、酶合成的阻遏
（1）酶合成的反馈阻遏作用（末端代谢 物阻遏、产物阻遏作用） 酶催化作用的产物或代谢物途径的末端 产物使该酶的生物合成受阻。引起反馈 阻遏的物质，称为共阻遏物（辅阻遏 物）。 组氨酸对组氨酸合成途径中的10种酶的 生物合成均起反馈作用
二、培养基的配制
培养基： 培养基的营养成分 （1）碳源 （2）氮源 （3）无机盐 （4）生长因素
三、发酵条件的控制
1、pH值调节：
2、温度调节： 热水升温、冷水降温
3、溶解氧的调节控制： 提高溶氧速率：通气量、氧的分压、气液
接触时间和面积，培养液的性质。
四、提高酶产量的方法
酶合成的调节机制：在正常情况下，酶 产量受酶合成调节机制的控制，要提高酶产 量必须打破这种调节控制。酶合成主要取决 于转录水平的调节，原核生物中普遍公认的 调节机制是操纵子理论。
Biblioteka Baidu
终产物Trp对色氨酸操纵子的调节
3、分解代谢物阻遏作用 葡萄糖效应 葡萄糖阻遏ß-半乳糖苷酶的生物合成；
葡萄糖效应
o 当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长 时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。 只有当葡萄糖耗净后，细菌经过一段停滞期， 不久在乳糖的诱导下β-半乳糖苷酶开始合成， 细菌才能充分利用乳糖。这种现象过去称为 葡萄糖效应。后来了解到这是由于葡萄糖降 解物引起的，因此又称为降解物阻遏 （catabolite repression）。受降解物阻 遏的酶类包括代谢乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、 麦芽糖等的操纵子。
Continue
同步合成型 ： 又称生长偶联型,是指酶合成与细胞 生长同步进行，当细胞生长进入对数期时，酶也大 量合成；当细胞进入稳定期时,酶的合成也停止。
延续合成型： 酶的合成伴随着细胞生长而开始，但 在细胞生长进入稳定期后,酶的合成仍将延续较长一 段时间。
中期合成型： 酶的合成在细胞生长一段时间后才开 始，而在细胞生长进入稳定期后,酶的合成也终止。
乳糖操纵子由三个结构基因（lacZ 、 lacY和 lacA）、操纵基因Olac、启动基因Plac、和调节 基因lacI所组成（图）
lacZ，编码β-半乳糖苷酶 lacY，编码β -半乳糖苷透性酶 lacA，编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶 Olac ，它位于启动子5`端的-5至+21之间。该
第四节 酶发酵动力学
• 发酵动力学：主要研究在发酵过程中细胞生长速 率，产物形成速率、基质消耗速率以及环境因素 对速率的影响；在酶的发酵生产中，研究酶发酵 动力学对于了解酶生物合成模式，发酵条件的优 化控制，提高酶产量具有重要的理论指导意义。
• 酶生物合成模式：根据酶的合成与细胞生长的关 系，可以把酶生物合成模式分为4种类型：同步合 成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。
• 2.1.1 RNA的生物合成——转录 • 2.1.2 蛋白质的生物合成——翻译 • 2.1.3 酶生物合成的调节
一、RNA的生物合成——转录
• 转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为 底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用 下，生成RNA的过程。
二、蛋白质的生物合成——翻译
lac 操纵子的正调控—分解代谢物阻遏
CAP---降解物基因活化蛋白
分解代谢物激活蛋白，cAMP受体蛋白
环腺苷酸受体蛋白CRP和CAP
细菌中cAMP的含量与葡萄糖的分解代谢有关。 当细菌利用葡萄糖为能源时，cAMP生成少而 分解多， cAMP含量低；当环境中无葡萄糖可 利用时， cAMP含量就升高。细菌细胞中含有 一种能与cAMP特异结合的cAMP受体蛋白CRP （cyclic AMP receptor protein，CRP）。CRP 未与cAMP结合时是无活性的。当cAMP浓度 升高，与CRP结合并发生空间构象的变化而活 化， cAMP与CRP结合生成的复合物即为CAP。 以二聚体的方式与特定的DNA序列结合。
翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物， 在核糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因 子的作用，合成多肽的过程。
四个阶段 1、氨基酸活化生成氨酰－tRNA 2、肽链合成的起始 3、肽链的延伸 4、肽链合成的终止
肽链的终止，释放和修饰
• 终止密码子 • 释放因子 • 肽链的修饰
三、酶生物合成的调节
打破酶合成调节限制的方法：
一、通过条件控制提高酶产量：
1. 添加诱导物 （1）酶作用的底物 （2）酶作用底物的前体物质 （3）酶的反应产物 （4）酶的底物类似物或底物的修饰物
2. 降低阻遏物浓度 3. 添加表面活性剂，促进分泌 4. 添加产酶促进剂
二、通过基因突变提高酶产量：
使诱导型变为组成型，使阻遏型变为去阻遏型
第二节 发酵工艺条件及控制
工艺流程
保藏细胞
原生质体
细胞活化 细胞扩大培养
固定化细胞
固定化原生质体
培养基
发酵
预培养 无菌空气
分离纯化
一、细胞活化与扩大培养
活化：使用以前，必须接种于新鲜的斜面培 养基上，在一定条件下进行培养，以恢复 细胞的生命活动能力。
扩大培养：增加发酵时的数量，经过一级至 数级扩大培养。培养基称为种子培养基。
操纵子模型（operon model)：是原核生物基
因表达的调节机制。大肠杆菌乳糖操纵子是第一个 被子发现的操纵子（Monod和Jacob，1961）
操纵子及调节基因示意图
酶合成调节的类型： 诱导和阻遏 1、酶合成的诱导 乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导a-淀粉酶的合成
①乳糖操纵子的结构
E.coli能利用乳糖作为碳源，而利用乳糖作为碳 源的酶只有当乳糖成为唯一碳源时才被合成。
滞后合成型： 只有当细胞生长进入稳定期后才开始 酶的合成并大量积累(图2-1)。
A
细胞浓度 B
酶浓度
酶浓度
细胞浓度
浓度
C
细胞浓度 D
酶浓度
酶浓度
细胞浓度
图2-1 酶生物合成模式
时间(h)
A.同步合成型; B.延续合成型; C.中期合成型; D.滞后合成型
影响酶生物合成模式的因素主要是mRNA和培养基中 存在的阻遏物： mRNA稳定性高的，可以在细胞停 止生长后继续合成相应的酶； mRNA稳定性差的， 随着细胞生长停止而终止酶的合成； 不受阻遏物阻 遏的,可随着细胞生长而开始酶的合成；受阻遏物阻 遏的,要在细胞生长一段时间或进入稳定期后解除阻 遏,才能开始酶的合成。
位点可被乳糖阻抑蛋白相结合。 lacI ，它是一个独立的调节基因，编码乳糖阻
抑蛋白。
乳糖操纵子模型
2、酶合成的阻遏
（1）酶合成的反馈阻遏作用（末端代谢 物阻遏、产物阻遏作用） 酶催化作用的产物或代谢物途径的末端 产物使该酶的生物合成受阻。引起反馈 阻遏的物质，称为共阻遏物（辅阻遏 物）。 组氨酸对组氨酸合成途径中的10种酶的 生物合成均起反馈作用
二、培养基的配制
培养基： 培养基的营养成分 （1）碳源 （2）氮源 （3）无机盐 （4）生长因素
三、发酵条件的控制
1、pH值调节：
2、温度调节： 热水升温、冷水降温
3、溶解氧的调节控制： 提高溶氧速率：通气量、氧的分压、气液
接触时间和面积，培养液的性质。
四、提高酶产量的方法
酶合成的调节机制：在正常情况下，酶 产量受酶合成调节机制的控制，要提高酶产 量必须打破这种调节控制。酶合成主要取决 于转录水平的调节，原核生物中普遍公认的 调节机制是操纵子理论。
Biblioteka Baidu
终产物Trp对色氨酸操纵子的调节
3、分解代谢物阻遏作用 葡萄糖效应 葡萄糖阻遏ß-半乳糖苷酶的生物合成；
葡萄糖效应
o 当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长 时，通常优先利用葡萄糖，而不利用乳糖。 只有当葡萄糖耗净后，细菌经过一段停滞期， 不久在乳糖的诱导下β-半乳糖苷酶开始合成， 细菌才能充分利用乳糖。这种现象过去称为 葡萄糖效应。后来了解到这是由于葡萄糖降 解物引起的，因此又称为降解物阻遏 （catabolite repression）。受降解物阻 遏的酶类包括代谢乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、 麦芽糖等的操纵子。
Continue
同步合成型 ： 又称生长偶联型,是指酶合成与细胞 生长同步进行，当细胞生长进入对数期时，酶也大 量合成；当细胞进入稳定期时,酶的合成也停止。
延续合成型： 酶的合成伴随着细胞生长而开始，但 在细胞生长进入稳定期后,酶的合成仍将延续较长一 段时间。
中期合成型： 酶的合成在细胞生长一段时间后才开 始，而在细胞生长进入稳定期后,酶的合成也终止。
乳糖操纵子由三个结构基因（lacZ 、 lacY和 lacA）、操纵基因Olac、启动基因Plac、和调节 基因lacI所组成（图）
lacZ，编码β-半乳糖苷酶 lacY，编码β -半乳糖苷透性酶 lacA，编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶 Olac ，它位于启动子5`端的-5至+21之间。该
第四节 酶发酵动力学
• 发酵动力学：主要研究在发酵过程中细胞生长速 率，产物形成速率、基质消耗速率以及环境因素 对速率的影响；在酶的发酵生产中，研究酶发酵 动力学对于了解酶生物合成模式，发酵条件的优 化控制，提高酶产量具有重要的理论指导意义。
• 酶生物合成模式：根据酶的合成与细胞生长的关 系，可以把酶生物合成模式分为4种类型：同步合 成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。