第3章 酶的生物合成与发酵生产

基因操纵子调节系统示意图
操纵子
控制区
调节基因 启动基因 操纵基因
信息区
结构基因 DNA
转录
RNA聚合酶 翻译
（ -） （+） 转录
mRNA 翻译
阻遏蛋白
蛋白质
诱导剂
酶 的 诱 导 和 阻 遏 操 纵 子 模 型
A.有活性阻遏蛋白
调节基因
阻遏蛋白 (有活性) 启动基因 操纵基因
结构基因
阻遏蛋白阻挡操纵基因 结构基因不表达
代谢产物
酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比
调控方式 阻遏蛋白 添加物 与操纵基 阻遏效应 因结合 酶的诱导 有活性 － ＋ 不转录， 继而不翻译 举例
诱导物
酶的阻遏 （反馈） 无活性 － 阻遏物
－
转录， 继而翻译
乳糖操 纵子
＋
不转录， 色氨酸 继而不翻译 操纵子
分解代谢物阻遏作用
启动子有两个位点： （1）RNA聚合酶的结合位点 （2）cAMP-CRP的结合位点。 CRP：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene activator protein），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。 只有cAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，RNA 聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才 能开始。 P S DNA O R
实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优
先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产 生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二 次生长现象”(diauxie或biphasic growth）。
这一现象又称葡萄糖效应， 产生的原因是由于葡萄糖降解 物阻遏了分解乳糖酶系的合成。 此调节基因的产物是环腺苷酸 受体蛋白（CRP）,亦称降解物 基因活化蛋白（CAP）。
减少酶合成对诱导物的依赖性，突变发生在调节基因， 使它不能形成阻遏物或失去了结合阻遏物的能力。
筛选方法（1）：在基质诱导物限制条件下进行恒化培 养，筛选出不需要诱导物的突变株。
（2）在只含有非诱导物基质的培养基上筛选。
(2)使阻遏型变为去阻遏型 获得在引起阻遏的条件下酶的产量也达到无阻 遏水平
2. 基因工程育种
B.有活性阻遏蛋白加诱导剂
mRNA 酶蛋白 诱导物 诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起 到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达
C.无活性阻遏蛋白
mRNA
阻遏蛋白(无活性)
酶蛋白 阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达
D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂
代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋 白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达
CRP-cAMP 复合物
CRP+cAMP
cAMP-CRP复合物的作用示意图
分解代谢物阻遏
CRP 基因 CRP结 合部位
结构基因
P O
R
T
LacZ
LacY
Laca
T 基 因 表 达
mRNA
RNA 聚合酶 mRNAZ mRNAY mRNAa
CRP
cAMP -CRP
葡萄糖降解物与cAMP的关系
ATP 葡萄糖
60 50.0
酶浓度 (单位 ) /ml
细 胞浓度 酶浓度
25.0 20 12.5
0
0
40
时间 (h)
80
120
0.0
黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲线
胞浓度 (g/L) 细
40
37.5
酶生产中最理想的合成模式：
延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显 差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进 入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。 对于：
分解代谢物阻遏

指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮 源）存在时，利用快的那种分解底物会阻 遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。
分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利 用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通 过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所 产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。

分解代谢物阻遏现象：
降低cAMP浓度 cAMP 使CRP呈失活状态
腺苷酸 环化酶 cAMP
5'-AMP
抑制
磷酸二酯 酶 激活
分解代 谢产物
乳糖操纵子基因转录正负调控作用
乳糖操纵子负调节作用 没有乳糖时，乳糖操纵子相邻的调节基因 lacI 编码的阻遏蛋白LacI 与操纵基因结合以阻止RNA聚合酶的转录；当培养基中只存在乳糖时，乳 糖与LacI结合，使LacI构象发生改变并从操纵基因上脱落，与启动子结 合的RNA聚合酶开始转录。这就是酶的诱导作用，半乳糖苷酶的底物乳糖 是生理诱导剂。 乳糖操纵子正调节作用
定义
以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在
RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子
的过程。 转录生成的RNA按其结构和功能不同，可以分 . 成mRNA,tRNA和rRNA。
RNA链的延伸图解
模板链（反义链） 有义链 复链 解链
3´
RNA-DNA杂交螺旋
新生RNA 聚合酶的移动方向 5´
延长部位
当环境中缺乏葡萄糖时，cAMP的浓度升高并与CRP 形成复合物，使
cAMP-CRP复合物就能够结合到乳糖操纵子上的结合位点，CRP与 RNA聚合 酶的相互作用促使转录启动。相反，如果培养基中存在葡萄糖，葡萄糖
代谢导致cAMP浓度下降，不结合有cAMP的CRP就不能与DNA结合，RNA聚合
酶 就 不 能 启 动 转 录 。 这 就 是 所 谓 的 分 解 代 谢 阻 遏 作 用 (catabolite repression)，又称葡萄糖效应
50
50 40 30 20
细胞 或酶浓 度
细胞 浓 度 (g/L)
细胞 酶
40 30 20 10 0
酶浓 度 细胞 浓 度
0 20 40 60 80
10 0
c
时 间
时 间 (h)
黑曲霉酸性蛋白酶合成曲线
酶浓 度 (U)
3.部分生长偶Biblioteka Baidu型（又称延续合成型）
酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进 入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。 特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。 所对应的mRNA相当稳定。
营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率
之间的动力学关系：Monod模型
dX 1 m S ＝ dt X K s S


µ :比生长速率（1/h） （specific growth rate）
µ ：最大比生长速率（1/h） max S：营养物浓度（生长限制基质浓度） 克/L 或 mol/L
三、提高酶产量的策略
（一）条件控制 1. 添加诱导物 诱导物分为4类：
1）酶的作用底物：淀粉，乳糖 2）酶作用底物的前体 3）酶的反应产物：纤维素酶的产物纤维二糖（一般为胞外 水解酶） 4）酶的底物类似物或修饰物：IPTG
筛选适当的诱导物，确定诱导浓度及诱导时间。


2. 降低阻遏物浓度 分解代谢物阻遏
1）尽量使用非阻遏性碳源（甘油，甘露糖） 2）采取流加方式限制阻遏性碳源

反馈阻遏
1）从培养基中去除终产物 2）添加阻止末端产物的抑制剂

3. 促进分泌 4. 添加产酶催进剂
表面活性剂，增加细胞通透性 植酸钙镁，聚乙烯醇，醋酸钠
（二）菌种选育（一劳永逸）
1.改良育种
(1) 使诱导型变为组成型——选育组成型突变株
酶的生物合成与细胞生长同步。 特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏 和反应产物阻遏。 当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成 立即停止，表明这类酶所对应的mRNA很不稳定。
细胞
细胞 或酶浓 度
酶
a
时 间
生长偶联型中的特殊形式——中期合成型
酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细 胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。 特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。
Ks：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数 克/L，
二、产酶动力学
（一） 酶生物合成的模式
在分批培养过程中，根据酶的合成与细胞生长
之间的关系，可将酶的生物合成分为3种模式，即： 同步合成型 生长偶联型—— 中期合成型 部分生长偶联型——延续合成型 非生长偶联型 —— 滞后合成型
1. 生长偶联型（又称同步合成型）
0.5 0.4
细胞 浓 度(OD500) 酶浓 度(U/mL)
细胞 浓 度 酶浓 度
0.3 0.2 0.1 0.0
0
2
4
6
8
10
时 间 (h)
枯草杆菌碱性磷酸酶合成曲线
2. 非生长偶联型（又称滞后合成型）
只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并 大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。 特点：受分解代谢物的阻遏作用。 所对应的mRNA稳定性高。
80
60
细胞 浓 度(OD)
40
20
0
0
2
4
6
8
时 间(h)
2. 反馈阻遏——末端产物阻遏 酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成 受阻的过程。 酶合成阻遏的现象：
实验：
（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测 到细胞内有色氨酸合成酶的存在；
（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸
（二）蛋白质的生物合成--翻译(translation)
定义 以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖 体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合 成多肽链的过程。
蛋白质的合成过程
（大肠杆菌）



氨基酸的活化 肽链合成的起始 肽链的延伸 肽链合成的终止与释放
肽链的后期加工



去除甲酰甲硫氨酸上的甲酰基 去除信号肽 磷酸化，形成二硫键 酶原，去除部分多肽
操纵子
控制部位
操纵基因（operator gene, O） 启动子（promotor gene, P）
调节基因(regulator gene)：常位于调控区的上游， 可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) 调节蛋白是一类变构蛋白，有两个结合位点：①操纵 基因；②效应物。 分为两种：1）阻遏物，没有诱导物时与操纵基因结合 2）阻遏物蛋白，只有在辅阻遏物存在时才 与操纵基因结合
（1）改造调节基因 （2）增加结构基因的拷贝数 （3）将目标基因转移到宿主细胞表达
第二节
酶发酵动力学
一、细胞生长动力学
在分批培养(batch culture)过程中，细胞
生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、
静止期和衰亡期5个阶段。
细胞浓度 (g/L)
O
A
B
C
D
E
培养 时间 (h)
细胞生长曲线 O-A 延迟期 A-B指数生长期 B-C减速期 C-D 静止期 D-E 衰亡期
诱导物：既可以是酶的底物，也可以是底物的结构类
似物，或底物的前体物质。


半乳糖苷酶 诱导物：乳糖，IPTG 同时诱导：几乎同时诱导几种酶的合成 顺序诱导：依次合成分解各中间代谢物 的酶
2. 阻遏 (repression) 能阻碍酶生物合成的现象称为阻遏 分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏(feedback repression)
合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现
了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。
（二）基因调控理论
操纵子：原核生物中，由几个功能相关的结构基因 及其调控区组成的基因表达的协同单位。
结构基因（编码蛋白质, structural gene, S）
Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory）
第三章
酶的生物合成与发酵生产
提取分离法 微生物细胞发酵产酶 植物细胞发酵产酶 动物细胞发酵产酶
酶的生产方法
生物合成法 化学合成法
第一节
酶生物合成及调节
一、酶的生物合成
遗传信息传递的中心法则
转 录 复制 传 DNA 递 转录 给 R N 逆转录 A 蛋白质 RNA ， 翻译 再 复制 由 R N
（一）RNA的生物合成--转录(transcription)
同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵
温度 。 滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。 中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方
面努力。
产酶动力学
一般产酶动力学方程可表达为：
dE X dt
式中 X——细胞浓度(g /L) ——细胞比生长速率(h-1) ——生长偶联的比产酶系数(IU/g) ——非生长偶联的比产酶速率(IU/(gh)) E——酶浓度(IU/L) t——时间(h)
二、酶生物合成的调节
基因转录水平的调节是微生物调节酶合成量 的重要机制。
意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物
合成的原料和能量。
(一) 酶合成调节的类型
1.诱导 (induction)
凡能促进酶生物合成的现象称为诱导。 组成酶：细胞固有的酶类。
诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似
物而临时合成的一类酶。