串联质谱技术的应用综述

《有机结构分析II》
串联质谱技术的应用
液相色谱-质谱法(LC/MS)将应用范围极广的分离方法与灵敏、专属、能提供相对分子质量和结构信息的质谱法结合起来, 因此已成为一种重要的现代分离分析技术。

虽然与LC相连的单极质谱仪也能够提供相对分子质量的信息, 但不足之处在于基质对待测组分的干扰难以排除及待测组分的结构信息不能充分利用。

液相色谱与串联质谱联用可在一级质谱MS条件下获得很强的待测组分的准分子离子峰, 几乎不产生碎片离子, 并可对准分子离子进行多级裂解, 进而获得丰富的化合物碎片信息, 可用来推断化合物结构, 确认目标化合物, 辨认重叠色谱峰以及在高背景或干扰物存在的情况下对目标化合物定量, 因而成为药物代谢过程和产物研究, 复杂组分中某一组分的鉴定和定量测定, 以及药用植物成分研究中更为强有力的工具。

本文对液相色谱-串联质谱法(LC-MSn)的原理及其在药物代谢方面的应用作简要介绍。

1 串联质谱(MS/MS)基本原理
1.1 离子源
离子源的种类包括:电子轰击电离(EI)、化学电离(CI)、快原子轰击(FAB)、场电离(FI)和场解吸(FD)、大气压电离源(API)、基质辅助激光解吸离子化(MALDI)和电感耦合等离子体离子化(ICP)等。

现在主要采用大气压离子化技术(API), 包括电喷雾离子化(ESI)、大气压化学离子化(APCI)和大气压光电离化(APPI)。

API 是软电离技术, 通常只产生分子离子峰, 因此可直接测定混合物。

其中,ESI应用十分广泛, 适用于极性、热不稳定、难气化的成分分离分析, 小到无机离子, 大到蛋白质、核酸。

ESI-MS中可以容易地控制碎片的裂解程度。

用串联质谱可以选择特定的离子, 通过碰撞诱导解离(CID)使其碎裂成碎片离子;另一种方法是通过改变锥孔(取样口)电压(源内CID)的方式, 无选择地将源内所有的离子击碎。

1.2 质量分析器及其特点
质量分析器是质谱计的核心, 不同类型的质量计其功能、应用范围、原理和实验方法均有所不同。

磁质谱:分为单聚焦磁场分析器和双聚焦分析器。

离子源中生成的离子通过扇形磁场和狭缝聚焦形成离子束。

离子离开离子源后, 进入垂直于其前进方向的磁场。

不同质荷比的离子在磁场的作用下, 前进方向产生不同的偏转, 从而使离子束发散。

由于不同质荷比的离子在扇形磁场中有其特有的运动曲率半径, 通过改变磁场强度, 检测依次通过狭缝出口的离子, 从而实现离
子的空间分离, 形成质谱。

高分辨的双聚焦质谱仪可以测定分子离子的精确质量数(误差在5 ppm以下), 可以确定元素组成。

四极杆分析器(简写为Q):因其由四根平行的棒状电极组成而得名。

离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦, 一个直流固定电压(DC)和一个射频电压(RF)作用
在棒状电极上, 两对电极之间的电位相反。

对于给定的直流和射频电压, 特定质荷比的离子在轴向稳定运动, 其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。

将DC和RF
以固定的斜率变化, 可以实现质谱扫描功能。

四极杆分析器对选择离子分析具有较高的灵敏度。

离子阱分析器(TRAP):由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。

端盖电极施加直流电压或接地, 环电极施加射频电压(RF),通过施加适当电压就可以形成一个势能阱(离子阱)。

根据RF电压的大小, 离子阱就可捕获某一质量范围的离子。

离子阱可以储存离子, 待离子累积到一定数量后, 升高环电极上的RF电压, 离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱, 被电子倍增监测
器检测。

离子阱分析器现已可以分析质荷比高达数千的离子。

离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度, 而且单个离子阱通过时间序列的设定就可以实现多
级质谱(MSn)的功能。

飞行时间分析器(TOF):具有相同动能, 不同质量的离子, 因其飞行速度不
同而分离。

如果固定离子飞行距离, 则不同质量离子的飞行时间不同, 质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。

各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。

离子以离散包的形式引入质谱仪, 这样可以统一飞行的起点, 依次测量飞行时间。

离子包通过一个脉冲或者一个栅系统连续产生, 但只在某一特定的时间引入飞行管。

TOF具有较大的质量分析范围和较高的质量分辨率, 尤其适合蛋白等生物大分子分析, 常用MALDI为离子源。

其分辨率随着质荷比的增大而降低。

傅里叶变换-离子回旋共振分析器(FT-ICRMS):在一定强度磁场中, 离子做
圆周运动, 离子运行轨道受共振变换电场限制。

当变换电场频率和回旋频率相同时, 离子稳定加速, 运动轨道半径越来越大, 动能也越来越大。

当电场消失时, 沿轨道飞行的离子在电极上产生交变电流。

对信号频率进行分析可得出离子质量。

将时间与相应的频率谱利用计算机经过傅里叶变换形成质谱。

优点为分辨率很高, 质荷比可以精确到千分之一道尔顿, 但价格十分昂贵。

液相色谱与串联质谱联用
的质量分析器中最常用的是四极杆分析器, 其次是离子阱分析器和飞行时间分析器。

1.3 串联质谱的方式
两个或更多的质谱连接在一起, 称为串联质谱。

串联质谱根据连接方式的不同一般分为空间串联和时间串联。

空间串联型又分磁扇型串联, 四极杆串联, 混合串联等。

如果用B表示扇形磁场, E表示扇形电场, 那么串联质谱主要方式有:空间串联(如磁扇型串联方式:BEB, EBE, BEBE等;四极杆串联:Q-Q-Q;混合型串联:BE-Q、Q-TOF和EBE-TOF等)②时间串联:离子阱质谱仪和回旋共振质谱仪。

另外, 还有Q-TRAP等。

1.4 串联质谱的工作
无论是哪种方式的串联, 都必须有碰撞活化室,从第一级MS分离出来的特定离子, 经过碰撞活化(碰撞气常用N2和Ar等)后, 再经过第二级MS进行质量分析, 以便取得更多的信息。

最常见的串联质谱为三级四极杆串联质谱(QQQ)。

第一级和第三级四极杆分析器分别为MS1和MS2, 第二级四极杆分析器所起作用是将从MS1得到的各个峰进行轰击, 实现母离子碎裂后进入MS2再行分析。

1.5 串联质谱数据采集方式
串联质谱主要有4种数据采集方式:①子离子扫描:选择一定的母离子经CID 活化, MS2记录产生的子离子。

该方式特别适合于软电离(如ESI,CI, FD, FAB)得到的分子离子进一步裂解以获得分子的结构信息。

通常先收集母体药物的子离子谱,再获得代谢物的子离子谱, 根据生物转化/代谢的位点, 可以提供丰富的结构信息。

合理化裂解的这些碎片离子通常可提示药物代谢物的可能结构。

②母离子扫描:选择MS2 中的某一子离子, 测定MS1中的所有母离子。

该方式能帮助追溯碎片离子的来源, 能对产生某种特征碎片离子的一类化合物进行快速筛选。

这种扫描功能在药物代谢中非常重要。

③中性丢失扫描:MS1 和MS2 同时扫描, 但MS2与MS1 始终保持质量差(即中性丢失质量)Am, 最终的谱图将显示那些来自一级谱图中通过裂解丢失中性碎片(Am)的离子。

中性丢失谱最能反映化台物的特定官能团, 如有中性丢失18Da的意味着-H2O。

中性丢失扫描广泛地用于测定II相代谢过程变化, 如葡萄糖醛酸苷(-176Da)和硫酸盐(-80Da), 同样可以测定谷胱苷肽(GSH)加合物(-129Da)。

④多反应检测(MRM)或选择反应监测(SRM):由MS1选择
一个或几个特定离子, 经碰撞碎裂之后, 由其子离子中选出一特定离子, 只有
同时满足MS1和MS2选定的一对离子时, 才有信号产生。

用这种扫描方式的好处是增加了选择性, 即使2个质量相同的离子同时通过了MS1, 但仍可以依靠其子离
子的不同将其分开。

这种方式非常适合于从很多复杂的体系中选择某特定质量, 经常用于微小成分的定量分析。

空间串联质谱的3种方式为子离子扫描、母离子扫描和中性丢失扫描, 而时间串联质谱只能完成子离子扫描。

目前, 这4 种扫描方式已越来越广泛地应用在药物代谢研究方面。

2 串联质谱法在药物代谢中的应用
药物代谢涉及药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄的研究。

包括药物及其在各种复杂基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织)中代谢物的分离、结构鉴定以及痕量分析测定。

2.1 药物及其代谢物的痕量分析
测定药物代谢动力学参数以研究药物的生物利用度和生物等效性为主, 常
用QQQ, 因其具有较高的选择性、信噪比。

生物样品中有大量的保留时间相同、相对分子质量也相同的干扰组分存在。

为了消除其干扰, 定量的最好办法是采用串联质谱的多反应监测(MRM)技术。

分析样品时, 第一级质谱选定m1 , 经第二级碰撞活化后, 第三级质谱选定m2 。

只有同时具有m1 和m2 特征质量的离子才被记录。

这样得到的色谱图就进行了3次选择:LC选择了组分的保留时间, 第一级MS 选择了m1 , 第三级MS选择了m2 , 这样得到的色谱峰可以认为被干扰的几率极小。

然后, 根据色谱峰面积, 采用内标法进行定量分析。

这是目前应用最多的一种测定方法, 如Suryawanshi等[1]利用MRM技术测定大鼠血浆中芒果苷和4种环烯醚
萜苷的药动学参数;沈凯等[2]利用MRM技术定量测定人血浆中替比夫定的浓度;
徐珊珊等[3]利用MRM技术同时测定人血浆中西替利嗪和伪麻黄碱的浓度, 均取
得较好的测定结果。

2.2 药物代谢物的结构鉴定
由于多数药物的代谢物保留了母体药物分子的骨架结构或一些亚结构, 因此, 代谢物可能进行与母体药物相似的裂解, 丢失一些相同的中性碎片或形成
一些相同的特征离子, 用串联质谱分别进行中性丢失扫描、母离子扫描和子离子扫描, 即可迅速找到可能的代谢物, 并鉴定出结构。

Yost等[ 4] 总结了和用串联质谱鉴定药物代谢物的方法, 主要包括以下几个步骤:①测定母体药物的质
谱。

②测定母体药物的子离子谱, 选择质子化分子离子、加合离子和主要的碎片离子进行裂解。

③选择母体药物的主要中性丢失测定生物样品的中性丢失谱, 图谱中的离子即为母体药物和可能的代谢物的分子离子。

④选择主要的子离子测定生物样品的母离子谱, 所得母离子即为各个代谢物。

⑤测定生物样品中所有可能代谢物的子离子谱, 解谱得到代谢物的结构。

⑥测定代谢物的子离子谱.选择任一新出现的中性丢失和子离子重复进行步骤③, ④。

2.2.1 QQQ在药物代谢产物鉴定中的应用
药物代谢的研究中, 由于母体药物结构已知, 药物代谢途径常常可以预期, 根据体内I相和II相代谢的一般规律(见表1和表2), 张喆等[5]用高效液相-电喷
雾串联四极杆质谱法首次考察了毛果芸香碱在大鼠尿中的代谢情况, 采用MRM方法推测了毛果芸香碱在大鼠体内的5种代谢产物。

表1 I相代谢过程的质量偏移[6]
表2 II相代谢过程的质量偏移
目前利用QQQ在药物代谢产物鉴定中的应用较少, 张爱军等[7]用QQQ推
测了西维来司他药物降解产物的可能结构和裂解途径, 方法是先对药物的准分
子离子峰进行子离子扫描, 再对降解产物的质谱峰进行子离子扫描, 通过母离
子扫描、子离子扫描、中性丢失和调节去簇电压(DP)值等方法对离子裂解规律进行分析, 推测了降解产物结构。

这种方法可在药物代谢产物鉴定中得以借鉴。

2.2.2 TRAP和Q-TRAP在药物代谢产物鉴定中的应用
离子阱质谱仪属于时间上的串联质谱。

与QQQ相比, TRAP在MS和MS/MS的全扫描功能上更强, 而且它的多级质谱测定(MSn)灵敏度较好, 并能解释分子裂解过程。

现在常常应用此功能进行代谢物鉴定。

如陈勇等[8]利用HPLC-ESI-ITMSn法
鉴定麻黄碱及其大鼠体内主要代谢产物, 采用CID对其母体药物准分子离子进行MSn分析, 总结其电喷雾质谱的一级电离规律和多级质谱裂解规律, 以此作为麻黄碱大鼠体内代谢物分析鉴定的依据, 在尿样中鉴定出3个第1相代谢产物, 未
发现第II相代谢产物。

陈怀侠等[9]应用HPLC-MSn分析水苏碱及其大鼠体内代谢物, 依据药物生物体内代谢规律, 推测出水苏碱在大鼠体内的可能代谢物, 采用CID 对其母体药物准分子离子进行MSn分析, 利用MSn技术对可能代谢物进行鉴定和
结构认证。

TRAP具有低质量截止点(1/3 效应)、碰撞效率低和定量分析性能较差等缺憾, 而Q-TRAP不但可以克服这些缺点, 而且可以选择母离子扫描和中性丢失扫描等。

Q-TRAP用于代谢产物是相对较新的方法, 其组成相当于QQQ中的第3个Q用线性离子阱代替, 可以得到更丰富的数据。

如用四极杆-线性离子阱(Q-LIT)研究大鼠脑中6-氨基丁基苯酞代谢物[10] , 用Q-LIT同时测定母体药物和可预测的代谢物[11]等。

2.2.3 Q-TOF在药物代谢产物鉴定中的应用
QTOF可以精确测定母体药物或代谢产物分子以及由CID产生的碎片离子的质量, 从而获得其元素的组成, 但在子离子扫描、中性丢失和MRM等方面存在局限性。

王英武等利用Q-TOF技术研究3种β2 -受体激动剂的质谱裂解特征, 为其体内代谢转化和定量分析研究提供有力的依据。

如利用Q-TOF对波生坦代谢物的研究, epothiloneB体内代谢物的研究, 吗氯贝胺和雷米克林代谢物的性质, 酚哌丙酮I相和II相代谢产物的鉴定,ethoxidine体内代谢物的鉴定[12] 等。

2.2.4 不同串联质谱方法在药物代谢产物鉴定中的比较
尽管QQQ在药物生物转化与代谢产物鉴定上取得显著的贡献, 但他的局限性在于四极杆质量分析器没有足够的质量准确度, 不能给出母离子和子离子的元素组成, 因此, 用于结构鉴定有时不够明确, 因为同分异构物以及其他代谢物可能产生结构不同但质量相同的母离子, 导致子离子谱的重叠。

Q-TOF可以给出母离子和子离子的准确质量, 但只有当母离子不受元素组成相同的离子的干扰时, 才可能用子离子的准确质量测定去做结构解析。

QQQ以及Q-TOF还有一个局限性是产生的CID图谱不能将一级子离子与二级或三级分解子离子区分开来, 使图谱解析变得困难。

而Q-TRAP可以在质谱分析的每一阶段将母离子隔离并捕获, 从而可以确定离子的亲缘关系, 使代谢物的CID图谱的解释变得较为容易。

3 液相色谱-串联质谱技术在食品中抗菌药物残留分析中的应用
3.1 β－内酰胺类
β－内酰胺类( β－ Lactams) 是指分子结构中具有β－内酰胺环的一大类抗生素，是目前应用最为广泛的治疗动物细菌感染的抗菌药物，分为青霉素和头孢菌素两大类。

孙雷等[13]建立了动物源性食品中13 种青霉素和头孢菌素类抗生素残留检测的超高效液相色谱－串联质谱( UPLC－ESI－MS /MS) 方法。

样品经乙腈－水溶液提取，正己烷脱脂，C18固相萃取柱净化并浓缩后，经C18色谱柱
分离，正离子模式多反应监测，检出限1ng /g，回收率79%～99%。

陈锦[14]比较
研究了动物肌肉组织中青霉素多组分残留的液相色谱－三重四极杆串联质( LC － QqQ) 和液相色谱－飞行时间质谱( LC－ ToF) 检测方法，提出ToF 在精密度、检出限以及回收率方面均不如QqQ。

3.2 四环素类
四环素类( Tetracyclines) 是由放线菌产生的具有氢化并四苯环结构的一类广谱抗生素。

由于其抗菌谱较广且价格低廉，目前仍广泛应用于畜禽养殖业中疾病的治疗以及用作促生长剂。

四环素类抗生素分子结构中具有两个易与金属离子螯合的酮羰基，大大影响样品前处理时的提取效率。

因此，在进行四环素类药物残留分析时常在提取溶剂中添加螯合剂( 如草酸和EDTA 盐) 。

刘蓉蓉等[15]建立了蜂蜜中4 种四环素类抗生素( 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素) 及其3 种差向异构体( 差向四环素、差向土霉素、差向金霉素) 的LC－ ESI－MS /MS 检测方法。

样品经EDTA－Mcllvaine 缓冲液提取，HLB 及羧酸弱阳离子固相萃取柱净化后进行测定，在10 ～500μg /kg添加范围内线性良好，回收率64.9% ～91.0%，相对标准偏差(RSD) 小于10.5%，方法定量准确，重现性好。

3.3 大环内酯类
大环内酯类( Macrolides) 是一类具有十二元、十四元或十六元内酯环配糖体的抗生素。

这类抗生素具有亲脂性，因此常用的有机溶剂( 如乙腈、氯仿、二氯甲烷) 均可将其从样品基质中提取出来。

Wang等[16]比较研究了鸡蛋、生鲜乳
及蜂蜜中6 种大环内酯类抗生素残留的液相色谱－三重四极杆串联质谱( LC－QqQ) 和液相色谱－四极杆串联飞行时间质谱( LC－QToF) 检测方法。

样品经乙腈或者磷酸盐缓冲液( pH8.0) 提取，固相萃取柱净化后进行测定，QToF的全扫描模式可以得到这几种大环内酯类药物的精确质量数，同时鉴别其降解产物; 而QqQ 的多反应监测模式在灵敏度和重复性方面具有更大的优势。

郭春海等[17]建
立了测定牛奶和奶粉中吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素和泰乐菌素残留的LC－ ESIMS/MS 方法，采用乙腈提取目标物，HLB 固相萃取柱净化，检出限1～
8μg /kg，回收率81.5%～96.1%，该法回收率高，重现性好。

3.4 氨基糖苷类
氨基糖苷类( Aminoglycosides) 是一类由氧桥连接氨基糖与氨基环醇而成
的苷类抗生素，是从链霉菌或者小单孢菌中提取，以天然品为原料合成或半合成制得的，包括链霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉素和新霉素等。

氨基糖苷类分子结构中多个极性基团的存在使得这类抗生素极性很强，在C18色谱柱上保留很弱，因而在进行液相色谱分离时需要在流动相中加入离子对试剂七氟丁酸( HFBA) 或五氟丙酸( PFPA) 。

Zhu 等[18]研究了不同食品基质中13 种氨基糖苷类抗生素残留的LC－ESI－MS /MS 检测方法。

样品经5%三氯乙酸溶液提取，HLB 固相萃取柱净化后测定。

由于其中7 种氨基糖苷类抗生素在pH ＜ 1 时保留较好，而另外6 种在pH8.5 时保留较好，净化时将两种不同pH 的HLB 固相萃取柱串接可同时净化这13 种药物。

龚强等[19]研究了乳制品中10 种氨基糖苷类抗
生素残留的LC－ESI－MS /MS检测方法，样品提取液通过HLB 固相萃取柱净化后测定，方法定量限10～20μg /kg，回收率71.2%～101.7%，该法操作简便且灵敏度较高。

3.5 酰胺醇类
酰胺醇类( Amphenicols) 是指一类具有酰胺醇结构的抗生素的总称，包括氯霉素、甲砜霉素等，是一类广谱抗生素。

酰胺醇类抗生素在食品中的残留会对人类的健康构成直接或潜在的威胁，特别是氯霉素具有抑制造血机能的毒副作用，导致人类再生障碍性贫血，许多国家已严格禁止将氯霉素用于食用动物养殖业中。

我国于2002 年起禁止在食用动物的所有用途中使用氯霉素。

陈小霞等[20]建立了鸡肉组织中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留的LC－ESI－MS /MS检测方法。

样品经乙酸乙酯提取，正己烷脱脂，浓缩后定容直接测定，检出限为0.010μg /kg，线性范围0.050～1.00μg /kg，加标回收率69.0%～92.8%，该方法通过简单的液液萃取过程提取净化，具有操作简便、测定周期短等优点。

巩军等研究了乳及乳制品中氯霉素残留的UPLC－ESI－MS /MS 检测方法，方法检出限0.05 ～0.1μg /kg，回收率75.0%～94.6%。

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