植物内生菌分离处理方法

d植物内生菌分离处理方法

文献材料前处理第一次消毒第二次消毒（含三

消）

处理对照培养基

刘明志，2011 南方红豆杉

的老树皮、幼

茎、叶

截成2～3 cm长的

小段，去除树皮层

75%酒精中浸泡30

s

0．1%升汞溶液浸泡

8 min，无菌水冲洗

3～5次

研磨成匀浆液，倾

倒于PDA上

切成0．5 cm左右的

块，接种于有100 mg L

－1青霉素和链霉素的

PDA固体培养基表

面。每皿10块

刘金花2011 黄花蒿的根，

茎，叶

叶切成1cm2,茎和

叶切成1cm左右小

段（两端皆有切口）

将根，茎，叶一次

用75%酒精浸

1min

1%的次氯酸钙溶液

浸泡1min,用无菌水

冲洗5次

置于含双抗的V A

培养基平板培养

待切口处长出菌落后

转至PDA培养基进行

内生真菌的分离

宋培勇2011 珙桐茎、叶和

叶柄

将采集的新鲜珙桐

的茎、叶和叶柄分

别用流水冲洗, 风

干表面水分, 剪成

小块或小段,

无菌水漂洗2 次

75%酒精浸泡 1

min

再用2%

NaClO 溶液中浸泡

3 min, 转入75%酒

精中浸泡30 s,

接着用无菌水漂洗

3 次,

取最后一次漂洗液涂布

NA 平板作为对照

平放于NA 平板上,

28 °C培养2?3 d

孙传伯2011 台湾7303毛

豆全株

采回的样本用自来

水洗净, 并用无菌

纸吸干水分, 并用

无菌纸吸干水分,切

取支根110 cm长的

小段, 须根切成

115 cm的小块

用75% 酒精浸泡

5m in、7m in、10m

in

分别用0.1% 升汞

溶液处理4 m in、6

m in、8 m in进行表

面灭菌,此试验分别

重复3次。最后用

无菌水冲洗4次,。

最后用无菌水冲洗

4次

将组织块在研钵

中充分研磨成匀

浆

最后一次冲洗液涂3种

不同培养基平板, 26~ 28e

下培养2~ 3d, 筛选出最

佳消毒时间和培养基, 将

表面消毒彻底棉花根部

切块放入灭菌研钵中用

无菌水冲洗4次,取上清

液涂抹于培养基上。以无

菌水冲洗为对照试验。

取上清匀浆涂抹于3

种不同培养基上, 取

匀浆涂布于不同培养

基平板, 每浓度重复

3次, 然后将培养皿置

于26~ 28e 恒温箱中

培养2~ 3d, 观察培养

出的菌落形态

张鑫2011 植物圣罗勒

的健康

叶子

将叶子用流水冲洗

10 min

1% 的次氯酸

钠中浸泡10

min

0．02 mol / L、pH

7．0 的无菌磷酸

钾缓冲液( PB) 漂

洗

4 次

加无菌水将材料

研磨

涂布培养

李铭, 2011 石耳目地衣为了诱导产孢，黑化菌

株在光照/黑暗( 12 h∶

12h) 条件下，于2%的

PDA

培养基上，18℃下培

养 3 个月

刘杰凤2011 健康的小白

菜，染病的小

白菜根，茎，

叶

流水冲洗干净，剪

成小段

75％酒精中浸泡3

min

10％次氯酸钠浸泡

茎为8 min，根和叶

由于气孔较茎大，

浸泡5 min即可，然

后用无菌水浸泡多

次，每次3 min

无菌条件下用适

量的

PBS

缓冲液捣碎

以最后一次的漂洗液作

对照

，30 ℃

下培养

一个星期

搅拌后静置3 min，取

上清液0．5 mL分别

涂布于分离培养基平

板上，每种材料做3

次平行

朱士茂2011 新采集的银

杏枝条，叶子

和根

在自来水中冲洗干

净，然后将枝条和

根截成 3 －4cm

长，将叶子和叶柄

分开，分别将根，

枝，叶放在不同的

灭菌后的广口瓶中

（一），根的表面

灭菌: 0. 1%的土温

20 消毒1min，无

菌蒸馏水冲洗 2

次。

（二）枝，叶和叶

柄：75% 的乙醇

消毒30s，无菌蒸

馏冲洗3 次

(一）,根：75%的乙

醇消毒30s，无菌蒸

馏水冲洗 2 次，0.

1% 升汞消毒

5min，无菌蒸馏水

冲洗 5 次。

(二）枝，叶和叶柄：

0. 1% 升汞消毒

7min，无菌蒸馏水

冲洗 5 次

茎，将其表皮剥

离，用无菌小刀纵

切表皮取其中间

的部分，然后将其

切成0. 5cm ×0.

5cm 大小

叶和叶柄，用研钵

将叶磨碎( 内放

石英砂和生理盐

水) 然后用无菌

移液管吸取0.

2ml 放入培养皿

中

①将以上接入的每种平

皿按相同的方法接入

5min 后用无菌镊子取

出;②用无菌蒸馏水冲洗

已表面灭菌后的材料，然

后将此液体移入培养基

中，培养观察。

KB 培养基:

PL 培养基:

PDA 培养基:

肖淑贤2011. 长势好、无病

害的植株

在自来水中冲洗干

净

采用升汞、乙醇、

H2O2、次氯酸钠等

表面消毒剂进行消

毒，无菌水冲洗

直接切取植物组

织或榨取植物组

织汁液稀释

王剑峰2011 取生长15

天马铃薯

无表面灭菌方法马铃薯内生菌单菌落

的分离取生长15 天

马铃薯LK99 组培苗,

剪成长度约 1.0 cm

的带腋芽茎段接种于

PSA 培养基上,分别于

光下(28℃、2200Lx、

16hr 光/8hr 黑暗)或

28℃暗培养,3 天后光

下和黑暗条件下组培

苗周围的培养基上出

现黄色菌块,挑取黄色

菌块,用稀释涂布法

[66]分离单菌落。

李晓红不同表面消毒

方法对核桃叶

内生菌分离效

果的比较

内容残缺）

熊亚南2011 刺五加植株

流水冲洗去

土，根，茎，

根茎等部

流水冲洗去土按根，茎，根茎等

部进行分割，每段

长10cm左右，按

下列程序表面消

毒：无菌水冲洗→

95%酒精漂洗

1min→6%的Naclo

浸3min

75%的乙醇漂洗

0.5min→无菌水漂

洗3次

进行分割，每段长

10cm左右

同样处理的材料不做切

割直接滚印于对照平板，

并去最后一次漂洗的无

菌水平板涂布，置相同条

件下培养，无菌长出即为

表面消毒彻底。

NA培养基。将上述处

理过的材料韧皮部与

木质部无菌分离，韧皮

部切成约

0.5cm×0.4cm的薄片，

然后将薄片直插入和

水平贴附两种方式置

于分离平板上，

25-28℃暗箱培养，带

材料边缘有菌苔长出

后转接与纯化平板划

线法分离纯化，镜检验

纯后转接到斜面。

邓正山2012 健康的大蒜

鳞茎

用纯净水冲洗干净依次用体积分数７

５％的乙醇浸泡３

ｍｉｎ

０．１％的氯化汞

表面消毒１５ｓ，

再用无菌水漂洗５

次

杨明琰2012 新鲜的杜仲将新鲜植物材料

用自来水冲洗外表

面直至干净，晾干。

用无菌刀将样品切

割成３ｃｍ左右的

小段

７５％的酒精溶液

中浸泡６ｍｉｎ，

用无菌水冲洗样品

表面３～５次

再在４％的次氯酸

钠溶液中浸泡３ｍ

ｉｎ，用无菌水冲

洗样品表面３～５

次

用镊子及解剖取

其韧皮部，切除两

端后切成大约１

ｃｍ×０．５ｃｍ

的小段

①漂洗液检验法：把最后

一次漂洗材料的无菌水

涂布于ＰＤＡ平板上，２

８℃恒温培养。②组织印

迹法：将上述表面灭菌处

理的完整枝段压入ＰＤ

Ａ平板内，使表面灭菌材

料与培养基接触３０ｍ

ｉｎ后，移去植物材料，

２８℃恒温培养。③组织

压入法：将灭菌材料不经

切割直接贴于ＰＤＡ培

养基表面，２８℃恒温培

养

将小段，贴于ＰＤＡ培

养基的表面，每皿放３

块材料，于２８℃恒温

培养箱内培养５～１

０ｄ。待菌丝从植物组

织长出后，从边缘挑取

菌丝移至另一ＰＤＡ

平板上进行纯化

胡秀荣2011 采集健康的

柑橘植株

放线菌

：先在自来水下冲

洗掉样品表面的泥

土，再用超声波清

放线菌：

然后用99%乙醇处

理1min，3%次氯

酸钠处理5min

放线菌：

最后用99%乙醇再

处理30s

放线菌：

灭菌好的材料用

无菌刀切成

1cm×1cm小块，

放线菌：

将最后一次处理植物样

品的清洗液涂在ISP2培

养基上，用以检测表面灭

洗置于分离培养基

表面

菌的效果

熊党生2012 取新鲜健康

的葛根的根、

茎、叶

分别用水冲洗干

净，用滤纸吸干水

分

无菌水冲洗2 遍，

先用体积分数75%

酒精浸泡 3 ～ 5

min( 叶子3 min，

茎 4 min，根

5min) ，无菌水冲

洗 3 ～ 4 遍

用0．1% 升汞浸

泡 2 ～4min( 叶

子 2 min，茎 3

min，根4 min) ，

无菌水冲洗 4 ～5

次

在无菌的条件下，

用灭过菌的手术

剪刀将植物根、

茎、叶剪成小段，

从中间剪开后，分

别置于含有葛根

浸出夜的PDA

琼脂培养基上，置

于生化培养箱中

培养一段时间

将上述经过表面消毒后

未作任何处理的材料直

接置于平板中，27℃培

养，结果材料周围未见任

何菌长出，证明所分离的

菌株为葛根的内生菌。

挑取内生细菌到牛肉

膏蛋白胨培养基中，挑

取内生真菌的菌丝到

PDA 培养基中纯化数

次，将纯化好的菌种接

种到斜面培养基上保

存备用

张彦涛2012 白蜡、茅草、

射干、罗布

麻、蓼草、胡

杨、怪柳。

取采集的新鲜样

品，用蒸馏水将植

物表面洗净

干后分别取其根、

茎、叶，在75% 乙

醇消毒液中浸泡

3～5min

3% 次氯酸钠浸泡

5min，75% 乙醇浸

泡5min。最后用无

菌水冲洗3～4 次

将样品在灭菌的

研钵中研磨，加适

量无菌生理盐水

研磨至匀浆状

最后一次冲洗的无菌水

涂布平板做空白对照

（分离培养基）取

1mL 液体分别按照

10-1、10-2、10-3、10-4、

10-5、10-6、10-7依次

梯度稀释，并分别涂布

平板，37℃恒温培养

2d。

红树林

内生放

线菌

文件不完整

李雁津2012 完整交城骏

枣,

用自来水清洗表面

后再用无菌水冲洗,

晾干称重后浸入

30%的乙醇中3 min

浸入 2.6%的次氯

酸钠溶液中5 min

浸入30%的乙醇中

30s进行表面消毒,

最后用无菌水冲洗

5次,晾干

用无菌剪刀将枣

果去皮,果肉剪碎,

加入无菌生理盐

水研磨

取最后一次淋洗水150微

升涂于LB平板上,28°C

培养72小时,检测表面灭

菌效果。

将碾磨液分别涂布于

胰酶大豆琼脂培养基

(TSA)、任氏培养基

(R2A)、金氏培养基

(KMB)、肉汁胨培养基

(BPA)、LB培养基、

酵母膏蛋白胨琼脂培

养基(YPM)、无氮培养

基,28°C培养箱中倒

置培养3-7天。

张慧茹2012 挑选新鲜、生

长旺盛的葎

草，用保鲜袋

包装

用自来水冲洗干

净，置无菌操作台

中紫外灯照射 5

min 后晾干。

用75%酒精进行

全草消毒1 min

升汞消毒时间分别

为：根65 s、茎50 s、

叶35 s。再用无菌

水冲洗干净

将上述组织块剪

成0.5 cm×0.5

cm大小

分别取各种组织最后一

次冲洗的无菌水，涂布于

营养琼脂平板上；将表面

消毒处理过的完整的根、

茎、叶各组织贴压在PDA

培养基平板内；在超净工

作台内放置一敞开的

PDA 平板。将上述3 种

对照平板置于28 ℃恒

温培养箱内培养7 d，用

于检查表面灭菌效果。

置于马铃薯葡萄糖琼

脂（PDA）培养基中，

28 ℃恒温培养箱中培

养约5~7 d，待内生菌

长出后，挑取单个菌落

进行纯化，PDA 培养

基斜面保菌。

李勇2011 健康人参自来水将人参根表

面粘连的土壤清

洗，再用无菌水冲

洗 1 次

依次用70% 乙醇

浸泡3 min

2. 6% 次氯酸钠浸

泡 5 min，再用

70%乙醇浸泡30 s。

最后用无菌水淋洗

5 次

将无菌人参根剪

成碎块，放入无菌

研钵中，加入适量

无菌石英砂和生

理盐水( 0.

取最后一次淋洗液150

μL 涂平板，28 ℃培养

3 d，观察平板上是否有菌

长出

。取200 μL 稀释液

至细菌分离培养基，涂

布均匀。25 ℃恒温培

养7 d，记录每个平板

上的菌落形态及菌落

85%) ，充分研

磨，梯度稀释 1

万倍

数，纯化培养。

林娜2012 随机挑选

100g 左右

根、茎、叶、

果实

洗净风干75% 乙醇分别浸

泡2、3、1、1 min，

无菌水冲洗6 次，

无菌滤纸吸干

0．1%HgCl2分别浸

泡50、60、40、40 s，

无菌水冲洗6 次

加无菌石英砂研

磨，梯度稀释至

10－3，每一稀释

梯度涂布10 个

分离平板

每个样品都取最后一次

无菌水洗液涂于相应平

板上，以检测表面消毒是

否彻底

定期观察分离平板，挑

取单菌落划线纯化于

牛肉膏蛋白胨斜面上。

张鑫2012 无纹背苔藓取苔藓叶片用无菌

水洗净

紫外先线（功率

18QW）照射6min

（苔藓叶正反面个

照射30min）灭菌

然后用75%的酒精

漂洗15min ，用无

菌水冲洗3次，再

利用酒精灯火焰进

行表面灭菌

将验证表面无菌

的叶子于无菌碾

钵中碾磨，用无菌

水梯度稀释

将表面灭菌的叶子直接

贴于固体PDA和LB培养

基表面，28℃培养3-4h，

观察叶子周围是否长菌，

以检验鲜苔表面灭菌是

否彻底。

各取200微升稀释液

涂布于固体PDA和

LB培养基进行内生菌

的分离。根据菌落形

态，颜色等特征初步判

断处分理出菌落的中

类，并按常规的方法挑

取菌落保存。

蓝江林2012 香蕉，处于成

果期的健株

和病株各 1

株

将样品用自来水冲

洗干净，吸干水分，

称重

先用75%酒精浸泡

40 s 左右，用无菌

水充分淋洗

再用10% KClO3溶

液浸8 min，无菌水

反复淋洗，无菌滤

纸吸干

根部选取根尖和

根基部分;假茎部

从茎基部到茎顶

端等分为 5 段，

每段随机取样;

叶片根据生长的

位置分为上部、中

部和下部叶片，每

部分取叶基部中

部和叶尖部分

以组织消毒后无菌水淋

洗的最后淋洗液作为对

照, 涂NA 平板培养，如

长菌落, 则判定研磨液所

培养的菌落为非内生菌,

丢弃; 若对照中无菌落,

则基本可判定研磨液中

长出的菌落可能是内生

菌，纯化后保存待用。

在无菌研钵中充分研

磨匀浆，无菌水梯度稀

释至102、103和

104，取200 μL 稀释

液涂布于NA平板上，

每梯度 3 个重复，静

置20 min 后，30℃倒

置暗培养24 ~ 48 h。

史应武2012 新疆醉马草将醉马草的根、茎、

叶( 包括叶鞘) 、种

子分别用自来水冲

洗干净，

再用无菌水冲洗一

次; 在75% 的0

乙醇浸泡30s 将

醉马草的根、茎、

叶( 包括叶鞘) 、

种子分别用自来水

冲洗干净

然后在0. 1% 的升

汞中浸泡 1 min;

无0菌水淋洗 5

次，在无菌条件下

晾干

取最后一次淋洗水涂于

LB 平板上，28℃培养

72 h，检测表面灭菌效果

马赟2012 阿尔泰虫草取阿尔泰虫草用水

粗洗

再用乙醇擦洗

2min

然后在0. 1% 氯化

汞溶液中消毒 3

min，无菌水冲洗

4 ～6次

将虫草切成0.

1 ～0. 5 cm 长的

小段

将小段接到马铃薯培

养基( PDA) 、LB 培

养基培养

刘明志。南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离。热带亚热带植物学报，2011，19(4):360～364

剥取红豆杉的老树皮，截成2～3 cm长的小段，去除树皮层，先用75%酒精中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0．1%升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗3～5次。用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌解剖刀将小段切成0．5 cm左右长的小块，接种于加有100 mg L－1青霉素和链霉素的PDA固体培养基表面。每皿放置10块，依次编号，置于25℃恒温培养箱中培养。幼茎内生菌的分离方法同上，将幼茎切成1 cm长的小段，以伤口断面垂直接种于PDA 固体培养基上培养。红豆杉叶片内生菌的分离采用两种方法，第一种方法与树皮内生菌的分离方法类似，分离时将叶片切成2至3段，接种于PDA固体培养基上;第二种方法是将叶片消毒后用无菌研钵研磨成匀浆液，然后将研磨液倾倒于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。

1刘金花。黄花蒿内生菌的分离与初步鉴定。２０１１，３３（４）：２７～３０

黄花蒿的根，茎，叶，叶切成1cm2,茎和叶切成1cm左右小段（两端皆有切口），将根，茎，叶一次用75%酒精浸1min，再用1%的次氯酸钙溶液浸，置于含双抗的V A培养基平板培养泡1min,用无菌水冲洗5次。待切口处长出菌落后转至PDA培养基进行内生真菌的分离。

2宋培勇，珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析，2011, 38(1): 8?13

将采集的新鲜珙桐的茎、叶和叶柄分别用流水冲洗, 风干表面水分, 剪成小块或小段,无菌水漂洗2 次, 75%酒精浸泡 1 min, 再用2%NaClO 溶液中浸泡 3 min, 转入75%酒精中浸泡30 s,接着用无菌水漂洗3 次, 平放于NA 平板上, 28 °C培养2?3 d。取最后一次漂洗液涂布NA 平板作为对照。

内生菌分离和纯化。将NA 平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离1-2 次直到获得纯培养

3孙传伯。毛豆内生菌的分离及生物学特征观察。(2011)10- 0026- 02

（1）从供试材料上取植物组织1. 0 g, 用70% (体积分数)酒精浸泡30 s, 用无菌水漂洗后, 置于1% (体积分数)次氯酸钠水溶液中表面消毒3- 5m in(其中叶片和花消毒3 m in, 茎和果消毒5m in), 再取出植物组织用无菌水冲洗3次. 样品晾干后分别置于无菌研钵中加5 mL 无菌水研磨成浆状, 静置10- 15 m in后, 每一样品各取上层澄清液50 LL 分别涂布在培养基( NA、KB和TSA ) 平板上, 每种培养基涂布3皿, 28 e 黑暗培养48- 72 h, 计算每一平板的菌落数. 表面消毒后, 在研磨前取50 LL 无菌水冲洗液涂布平板;或是通过组织印迹试验, 将最后一次清洗的植物组织在培养基平板上印一下, 按上述条件培养48 h, 观察有无菌落产生, 以验证采用该消毒方法是否能杀死供试材料表生微生物. 根据菌落形态、颜色等挑取单菌落, 划线分离、纯化后保存、备用.在融化并冷却至45 e 的NA 培养基中加入待测病原菌的悬浮液, 其中每100 mL 培养基加 1 mL 细菌悬浮液, 倒入平板. 采用点接法将内生菌接种于NA平板上, 每个平板上等距离点接5株不同的内生细菌菌株, 每组进行2次平行试验, 在恒温箱中28 e 下培养, 2 d后观察有无抑菌圈生成. （2）采用组织切块法, 进行表面消毒,再用灭菌的蒸馏水清洗, 检验灭菌效果。内生细菌的分离前,将采回的样本用自来水洗净, 并用无菌纸吸干水分,切取支根110 cm 长的小段, 须根切成115 cm的小块, 进行组织表面清毒, 棉花根部切段后经无菌水冲洗3次,用75% 酒精浸泡5m in、7m in、10m in后, 然后分别用011% 升汞溶液处理4 m in、6 m in、8 m in进行表面灭菌,此试验分别重复3次。最后用无菌水冲洗4次, 最后一次冲洗液涂3种不同培养基平板, 26~ 28e 下培养2~ 3d, 筛选出最佳消毒时间和培养基, 将表面消毒彻底棉花根部切块放入灭菌研钵中用无菌水冲洗4次,取上清液涂抹于培养基上。以无菌水冲洗为对照试验。培养2d后观察灭菌效果, 直到彻底表面灭菌, 再进行最后的内生菌分离。将组织块在研钵中充分研磨成匀浆,取上清匀浆涂抹于3种不同培养基上, 取匀浆涂布于不同培养基平板, 每浓度重复3次, 然后将培养皿置于26~ 28e 恒温箱中培养2~ 3d, 观察培养出的菌落形态。

（3）再将材料放进经过紫外线消毒的超净工作台内, 切割成小段, 按常规无菌操作进行表面消费处理: 75% 乙醇浸泡3 min y无菌水冲洗 3 遍y011% 升汞浸泡8 m in y 无菌水冲洗3 遍。将上述处理过的材料经滤纸吸干水分后, 在无菌条件下切成015 cm@015 cm 的小块, 放置于新鲜的PDA 平板培养基上, 每个平板放置4 块, 28 e 恒温培养3~ 7 d。待切口边缘长出真菌菌丝, 及时转接至新鲜PDA 培养基上培养, 采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。同时, 以消毒后不做切割的材料作为空白对照, 同样条件下观察是否有菌长出, 结果对照材料周围无任何菌长出, 证明表面消费彻底。212 内生真菌的鉴定: 采用真菌学插片培养方法,对分离获得的见血封喉内生真菌进行显微形态特征( 菌丝、孢子形态等) 的观察、分类鉴定。分类检索参照文献报道[ 8]。213 内生真菌的发酵上清液制备: 将分离得到的菌株, 切取黄豆粒大小的菌丝块, 接种于PDB 培养基中。1 L 三角瓶装400 mL 培养液, 室温, 164 r/ min 振荡培养7 d, 同时以纯培养基作空白对照。无菌条件下取发酵液15 mL 于离心管中, 12 000 r/ min 离心30 min 后取上清液, 用012Lm 微孔滤膜滤过除菌, - 20 e 保存备用。214 抑菌活性测定: 采用杯碟法测定样品抑菌活性。金黄色葡萄球菌和MRSA 采用NA 培养基, 白色念珠菌采用YPD 培养基。将金黄色葡萄球菌、M RSA 和白色念珠菌分别制成一定浓度的菌悬液( 1@105~ 1@107cfu/ m L) , 用棉签将其均匀涂布在供试无菌培养皿中, 制成含菌平板, 然后在每个平板放入3 个牛津杯, 分别取样品200 微升加入其内, 同时以发酵纯培养基作阴性对照。金黄色葡萄球菌和M RSA 在37 e 下恒温培养, 白色念珠菌在28 e 下恒温培养。24 h 后观察结果, 测量并记录抑菌圈直径。每个样品做3 个重复, 以抑菌圈直径的平均值为试验结果

4张鑫，生菌的分离方法及其次级代谢产物研究,(2011)02-0023-04

内从药用植物圣罗勒的健康叶子上分离出4 种内生细菌OS －9、OS －10、OS －11和OS －12。他们首先将叶子用流水冲洗10 min，随后于1% 的次氯酸钠中浸泡10 min，再用0．02 mol / L、pH 7．0 的无菌磷酸钾缓冲液( PB) 漂洗4 次，每次洗后取100 μL 漂洗液转移到装有5 mL 肉汤培养基的离心管中，经过48 h 震荡培养( 条件是200 rpm，28 ℃) ，检测样品表面消毒是否彻底。分离过程为选用紫外线和75%酒精作为表面消毒剂，经过多次消毒，加无菌水将材料研磨后，再将研磨液涂布。

5李铭, 石耳目地衣(2011) 02-0014-07

无

6刘杰凤, 小白菜内生菌的分离及菌核菌拮抗菌的筛选（2011）13－2676-04

健康的小白菜，染病的小白菜。采回的植株用流水冲洗干净，剪成小段，75％酒精中浸泡3 min，再用10％次氯酸钠浸泡一定时间：茎为8 min，根和叶由于气孔较茎大，浸泡5 min即可，然后用无菌水浸泡多次，每次3 min，表面消毒检测至漂洗液无菌落长出为止，一般为3～4次。在无菌条件下用适

量的PBS缓冲液捣碎，充分搅拌后静置3 min，取上清液0．5 mL分别涂布于分离培养基平板上，每种材料做3次平行，以最后一次的漂洗液作对照，30 ℃下培养一个星期。挑取不同形态的菌落，平板划线进行3～4次的传代纯化、镜检、斜面低温保存。

选取具有明显菌核菌病症的小白菜，采用常规组织分离方法从长菌丝及菌核处取样，接种于PDA培养基中（添加10％的1 ／3 000孟加拉红溶液），30 ℃培养至长出白色菌丝后，取白色菌丝进行多次划线纯化至纯种，斜面低温保存。

7将朱士茂，银杏内生菌的分离与鉴定2011

新采集的银杏枝条，叶子和根放在自来水中冲洗干净，然后将枝条和根截成3 －4cm 长，将叶子和叶柄分开，分别将根，枝，叶放在不同的灭菌后的广口瓶中．之后在超净工作台进行消毒。

根的表面灭菌: 0. 1%的土温20 消毒1min，无菌蒸馏水冲洗2 次，75%的乙醇消毒30s，无菌蒸馏水冲洗2 次，0. 1% 升汞消毒5min，无菌蒸馏水冲洗5 次。枝的表面灭菌: 75% 的乙醇消毒30s，无菌蒸馏冲洗3 次，0. 1% 升汞消毒7min，无菌蒸馏水冲洗5 次，叶子和叶柄的灭菌: 75% 的乙醇消毒10s，无菌蒸馏冲洗3 次，0. 1% 升汞消毒5min，无菌蒸馏水冲洗5 次，对照实验: ①将以上接入的每种平皿按相同的方法接入5min 后用无菌镊子取出;②用无菌蒸馏水冲洗已表面灭菌后的材料，然后将此液体移入培养基中，培养观察。2. 3 内生菌的分离在超净工作台中用无菌镊子挑取根放在无菌培养皿中，将其表皮剥离，用无菌小刀纵切表皮取其中间的部分，然后将其切成0. 5cm ×0. 5cm 大小，插入到培养基中。茎皮内生菌的获取同上，其次茎的木质部切成半径1cm 长2cm 的部分接入培养基中。

叶，叶柄中内生菌的获取一是将叶切成0. 5 ×0. 5 大小接入培养基中，二是用研钵将叶磨碎( 内放石英砂和生理盐水) 然后用无菌移液管吸取0. 2ml 放入培养皿中，最后用玻璃涂棒涂布均匀( 以上材料均接入五种培养基中，且每种均接三次) 。对照实验: 将表面消毒过的材料用无菌镊子夹取后在培养基中滚动2min 后弃掉，而且最后一次永无菌蒸馏水冲洗的冲洗液转入到五种培养基中培养( 将上述培养皿放入温箱终于27℃培养) 。

8肖淑贤, 植物内生菌的研究概况及应用进展2011.01.013

分离时可选取长势好、无病害的植株。分离方法通常是直接切取植物组织或榨取植物组织汁液稀释。目前内生菌的分离过程一般采用表面消毒技术，采用升汞、乙醇、H2O2、次氯酸钠等表面消毒剂进行消毒，无菌水冲洗。常用平板划线和稀释涂布的方法纯化所分离出的内生菌，纯化后接种于试管斜面培养基上，在5℃温度下保存，供作进一步的筛选。

9王剑峰，马铃薯内生菌的分离纯化及马铃薯生长发育的影响2011,12:60-62

组培苗的培养方法有两种,第一种方法:取生长15 天马铃薯LK99 组培苗,剪成长度约 1.0 cm 的带腋芽茎段,接种于MS 培养基[64]上,于光下(2200Lx、16hr光/8hr 黑暗、28℃)或28℃暗培养。第二种方法:取生长15 天马铃薯LK99 组培苗,剪成长度约1.0 cm 的带腋芽茎段,接种于马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)[65]上,于光下(2200Lx、16hr 光/8hr 黑暗、28℃)或28℃暗培养。

马铃薯内生菌单菌落的分离取生长15 天马铃薯LK99 组培苗,剪成长度约1.0 cm 的带腋芽茎段接种于PSA 培养基上,分别于光下(28℃、2200Lx、16hr 光/8hr 黑暗)或28℃暗培养,3 天后光下和黑暗条件下组培苗周围的培养基上出现黄色菌块,挑取黄色菌块,用稀释涂布法[66]分离单菌落。

10李晓红，不同表面消毒方法对核桃叶内生菌分离效果的比较2012,28(28):163-168 （内容残缺不完整）

11熊亚南，刺五加内生菌的分离2011

刺五加植株流水冲洗去土，按根，茎，根茎等部进行分割，每段长10cm左右，按下列程序表面消毒：无菌水冲洗→95%酒精漂洗1min→6%的Naclo浸3min→ 75%的乙醇漂洗0.5min→无菌水漂洗3次→无菌滤纸吸干。将上述处理过的材料韧皮部与木质部无菌分离，韧皮部切成约0.5cm×0.4cm 的薄片，然后将薄片直插入和水平贴附两种方式置于分离平板上，25-28℃暗箱培养，带材料边缘有菌苔长出后转接与纯化平板划线法分离纯化，镜检验纯后转接到斜面。

将上述同样处理的材料不做切割直接滚印于对照平板，并去最后一次漂洗的无菌水平板涂布，置相同条件下培养，无菌长出即为表面消毒彻底。12邓正山，大蒜鳞茎中抗番茄灰霉病内生菌的筛选及其防治效果，（２０１２）０５－００５０－０７

选取健康的大蒜鳞茎，用纯净水冲洗干净，，依次用体积分数７５％的乙醇浸泡３ｍｉｎ和０．１％的氯化汞表面消毒１５ｓ，再用无菌水漂洗５次，将最后一次洗涤液作对照，以检测表面消毒是否彻底。取表面消毒彻底的大蒜鳞茎，在无菌条件下充分研磨，梯度稀释，用接种环蘸取大蒜鳞茎液，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线分离，２８℃培养４８ｈ，选择形态、大小和颜色等特征不同的菌落进行划线分离纯化，得到纯化菌株后，接斜面置于４℃冰箱保存备用［１０］。

13钟林芳，杜鹃花科植物菌根研究进展，2012，14( 3) : 145 －150

无

14杨明琰，杜仲内生真菌的分离鉴定及抗菌活性研究，２０１２，３２（１）：０１９３－０１９８

将新鲜植物材料用自来水冲洗外表面直至干净，晾干。用无菌刀将样品切割成３ｃｍ左右的小段，于７５％的酒精溶液中浸泡６ｍｉｎ，用无菌水冲洗样品表面３～５次，无菌滤纸吸干；再在４％的次氯酸钠溶液中浸泡３ｍｉｎ，用无菌水冲洗样品表面３～５次，无菌滤纸吸干。用镊子及解剖取其韧皮部，切除两端后切成大约１ｃｍ×０．５ｃｍ的小段，贴于ＰＤＡ培养基的表面，每皿放３块材料，于２８℃恒温培养箱内培养５～１０ｄ。待菌丝从植物组织长出后，从边缘挑取菌丝移至另一ＰＤＡ平板上进行纯化。对照设置：①漂洗液检验法：把最后一次漂洗材料的无菌水涂布于ＰＤＡ平板上，２８℃恒温培养。②组织印迹法：将上述表面灭菌处理的完整枝段压入ＰＤＡ平板内，使表面灭菌材料与培养基接触３０ｍｉｎ后，移去植物材料，２８℃恒温培养。③组织压入法：将灭菌材料不经切割直接贴于ＰＤＡ培养基表面，２８℃恒温培养。

15胡秀荣，柑橘内生菌的研究进展，2011

由于内生菌广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实等器官的组织中，所以分离时可以采集健康的植株，然后对样品进行一系列的表面消毒，其中包括酒精、次氯酸钠、高锰酸钾、升汞等消毒剂进行表面消毒，最后用无菌水冲洗干净，将消毒好样品进行无菌研磨，加入少量无菌水，吸取汁液涂平板，待长出细菌后，进行转接纯化，最后一次冲洗水涂板检测表面消毒是否彻底。

16熊党生，葛根内生菌的分离及其发酵产物抗氧化活性的初步研究，2012．01．009

取新鲜健康的葛根的根、茎、叶，分别用水冲洗干净，用滤纸吸干水分，采用本实验前期建立的方法进行表面消毒处理: 无菌水冲洗2 遍，先用体积分数75% 酒精浸泡3 ～ 5 min( 叶子3 min，茎 4 min，根5min) ，无菌水冲洗 3 ～4 遍，再用0．1% 升汞浸泡2 ～4min( 叶子 2 min，茎3 min，根4 min) ，无菌水冲洗4 ～5 次，处理完毕。

在无菌的条件下，用灭过菌的手术剪刀将植物根、茎、叶剪成小段，从中间剪开后，分别置于含有葛根浸出夜的PDA 琼脂培养基上，置于生化培养箱中培养一段时间，观察外植体侧面或顶端有菌落形成，挑取内生细菌到牛肉膏蛋白胨培养基中，挑取内生真菌的菌丝到PDA 培养基中纯化数次，将纯化好的菌种接种到斜面培养基上保存备用，空白对照: 将上述经过表面消毒后未作任何处理的材料直接置于平板中，27℃培养，结果材料周围未见任

何菌长出，证明所分离的菌株为葛根的内生菌。

17张彦涛，旱生植物内生细菌的分离及耐旱菌株的筛选鉴定，(2012)05-0124-05

材料：白蜡、茅草、射干、罗布麻、蓼草、胡杨、怪柳。

采用组织研磨法对典型旱生植物内生细菌进行分离[ 9 ]。取采集的新鲜样品，用蒸馏水将植物表面洗净，稍干后分别取其根、茎、叶，在75% 乙醇消毒液中浸泡3～5min，3% 次氯酸钠浸泡5min，75% 乙醇浸泡5min。最后用无菌水冲洗3～4 次，最后一次冲洗的无菌水涂布平板做空白对照。将样品在灭菌的研钵中研磨，加适量无菌生理盐水研磨至匀浆状。取1mL 液体分别按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7依次梯度稀释，并分别涂布平板，37℃恒温培养2d。若对照处理的分离培养基平板上无菌落出现，表明植物材料表面消毒彻底，分离到的是内生细菌。挑取单菌落转移至新的培养基平板上，划线法纯化，纯化好的菌株于－80℃冰箱保藏。

18红树林内生放线菌（文件不完整）

19李雁津，骏枣内生细菌的分离、鉴定与拮抗菌的筛选2012

取完整交城骏枣,用自来水清洗表面后再用无菌水冲洗,晾干称重后浸入30%的乙醇中3 min,再浸入2.6%的次氯酸钠溶液中5 min,之后浸入30%的乙醇中30s进行表面消毒,最后用无菌水冲洗5次,晾干,取最后一次淋洗水150微升涂于LB平板上,28°C培养72小时,检测表面灭菌效果。用无菌剪刀将枣果去皮,果肉剪碎,加入无菌生理盐水研磨,梯度稀释(稀释为IQi-lO7倍)后分别涂布于胰酶大豆琼脂培养基(TSA)、任氏培养基(R2A)、金氏培养基(KMB)、肉汁胨培养基(BPA)、LB培养基、酵母膏蛋白胨琼脂培养基(YPM)、无氮培养基,28°C培养箱中倒置培养3-7天。同时以最后一次洗漆的水作为对照。根据平板上长出菌落的形态、颜色、大小等挑取不同单菌落,反复划线纯化后接斜面保藏待用。

国内外学者用分离培养方法研究内生细菌时,采用了不同的培养基,分离结果的差值较大,本实验对分离内生细菌的常用培养基[68]:胰酶大豆琼脂培养基(TSA)、任氏培养基(R2A)、金氏培养基B(KMB)、肉汁胨培养基(BPA)、LB培养基、酵母膏蛋白胨琼脂培养基(YPM)、无氮培养基进行了选择,以使其能最大限度的分离红枣中的内生细菌。

20张慧茹，葎草内生真菌SS3的分离与鉴定，（2012）01-0026-03

挑选新鲜、生长旺盛的葎草，用保鲜袋包装，送实验室备用。将采集的葎草全草用自来水冲洗干净，置无菌操作台中紫外灯照射5 min 后晾干。用75%酒精进行全草消毒1 min，将葎草剪成根、茎、叶各组织块，不同组织升汞消毒时间分别为：根65 s、茎50 s、叶35 s。再用无菌水冲洗干净，将上述组织块剪成0.5 cm×0.5 cm大小，置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，28 ℃恒温培养箱中培养约5~7 d，待内生菌长出后，挑取单个菌落

进行纯化，PDA 培养基斜面保菌。

分别取各种组织最后一次冲洗的无菌水，涂布于营养琼脂平板上；将表面消毒处理过的完整的根、茎、叶各组织贴压在PDA 培养基平板内；在超净工作台内放置一敞开的PDA 平板。将上述3 种对照平板置于28 ℃恒温培养箱内培养7 d，用于检查表面灭菌效果。若没有菌落出现，说明植物表面菌被葎草内生真菌的分离经表面消毒效果检测，冲洗的无菌水、组织印迹培养及环境培养基均无菌生长，证明表面消毒彻底，植物切口培养的菌落为内生菌。从新鲜的葎草中共获得21 株内生真菌，命名为SS1~SS21。2.2 抗致病菌的内生真菌的筛选彻底消毒，所生长的菌为植物内生菌。

21李勇，人参内生细菌的分离及拮抗菌株的筛选，（2011）1202010

先用自来水将人参根表面粘连的土壤清洗，再用无菌水冲洗1 次。依次用70% 乙醇浸泡3 min，2. 6% 次氯酸钠浸泡5 min，再用70%乙醇浸泡30 s。最后用无菌水淋洗5 次，无菌吸水纸吸干人参根部残留水分。取最后一次淋洗液150 μL 涂平板，28 ℃培养3 d，观察平板上是否有菌长出，以确定灭菌是否彻底。将无菌人参根剪成碎块，放入无菌研钵中，加入适量无菌石英砂和生理盐水( 0. 85%) ，充分研磨，梯度稀释1 万倍。取200 μL 稀释液至细菌分离培养基，涂布均匀。25 ℃恒温培养7 d，记录每个平板上的菌落形态及菌落数，纯化培养。

22林娜，山苍子内生细菌的分离及抑菌活性研究，2012) 06 －03382 －03

随机挑选根、茎、叶、果实100g 左右，洗净风干，75% 乙醇分别浸泡2、3、1、1 min，无菌水冲洗6 次，无菌滤纸吸干，0．1%HgCl2分别浸泡50、60、40、40 s，无菌水冲洗6 次，加无菌石英砂研磨，梯度稀释至10－3，每一稀释梯度涂布10 个分离平板。每个样品都取最后一次无菌水洗液涂于相应平板上，以检测表面消毒是否彻底。定期观察分离平板，挑取单菌落划线纯化于牛肉膏蛋白胨斜面上。

23张鑫，苔藓内生菌Bacillus megaterium z12的分离，鉴定和抗菌活性帅选，（2012）06-1401-05

取苔藓叶片用无菌水洗净，紫外线（功率18QW）照射6min（苔藓叶正反面个照射30min）灭菌，然后用75%的酒精漂洗15min ，用无菌水冲洗3次，再利用酒精灯火焰进行表面灭菌。将表面灭菌的叶子直接贴于固体PDA和LB培养基表面，28℃培养3-4h，观察叶子周围是否长菌，以检验鲜苔表面灭菌是否彻底。将验证表面无菌的叶子于无菌碾钵中碾磨，用无菌水梯度稀释，各取200微升稀释液涂布于固体PDA和LB培养基进行内生菌的分离。根据菌落形态，颜色等特征初步判断处分理出菌落的中类，并按常规的方法挑取菌落保存。

24王宇光，香蕉内生拮抗细菌KKWB-10的分离鉴定及其内生性证明（文件不完整）

25蓝江林，香蕉植株内生细菌群落多态性研究,，2012, 20(3): 285~291

将香蕉植株分为根、茎、叶3 部分。根部选取根尖和根基部分; 假茎部从茎基部到茎顶端等分为5 段，每段随机取样; 叶片根据生长的位置分为上部、中部和下部叶片，每部分取叶基部、中部和叶尖部分。将样品用自来水冲洗干净，吸干水分，称重，先用75%酒精浸泡40 s 左右，用无菌水充分淋洗，再用10% KClO3溶液浸8 min，无菌水反复淋洗，无菌滤纸吸干。在无菌研钵中充分研磨匀浆，无菌水梯度稀释至102、103和104，取200 μL 稀释液涂布于NA平板上，每梯度3 个重复，静置20 min 后，30℃倒置暗培养24 ~ 48 h。统计菌落种类和数量。分别计数后用－80℃甘油冷冻保存待用。

以组织消毒后无菌水淋洗的最后淋洗液作为对照, 涂NA 平板培养，如长菌落, 则判定研磨液所培养的菌落为非内生菌, 丢弃; 若对照中无菌落, 则基本可判定研磨液中长出的菌落可能是内生菌，纯化后保存待用。

26史应武，新疆醉马草内生菌群落结构、2012) 52( 10)

将醉马草的根、茎、叶( 包括叶鞘) 、种子分别用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗一次; 在75% 的0乙醇浸泡30 将醉马草的根、茎、叶( 包括叶鞘) 、种子分别用自来水冲洗干净，s，然后在0. 1% 的升汞中浸泡1 min; 无0菌水淋洗5 次，在无菌条件下晾干; 取最后一次淋洗水涂于LB 平板上，28℃培养72 h，检测表面灭菌效果［11］。

27马赟，一株阿尔泰虫草内生菌的分离及抑菌活性2012．02．045

阿尔泰虫草，取阿尔泰虫草用水粗洗，再用乙醇擦洗2min，然后在0. 1% 氯化汞溶液中消毒3 min，无菌水冲洗4 ～6次后将虫草切成0. 1 ～0. 5 cm 长的小段接种于培养基中。马铃薯培养基( PDA) 、LB 培养基等。