核酸环介导等温扩增技术

作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院(蔡哲钧、冯杰雄);310006杭州,浙江大学医学院(朱圣禾)・综述・

核酸环介导等温扩增技术

蔡哲钧综述　冯杰雄　朱圣禾审校

【摘要】　介绍环介导等温扩增技术的基本原理、特点及应用前景。环介导等温扩增技术具有简单、快速、特异性强和扩增效率高等特点,目前可检测乙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、水痘2带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、SARS冠状病毒、呼吸道合胞病毒、西尼罗河病毒、结核分支杆菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌、螺旋体、肺炎链球菌和耶氏菌等。

【关键词】　核酸类;　基因扩增

上世纪90年代以来,出现了几种新的核酸扩增方法:核酸等温扩增法(nucleic acid sequence2based amplification,NAS2BA)、自序列复制法(self2sus2 tained sequence replication,3SR)和链置换扩增法(st rand displacement amplification,SDA)等。Noto2 mi等[1]于2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法,即环介导等温扩增法(loop2mediated isot hermal amplification,LAM P),其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAM P是一种崭新的DNA扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点,具有替代PCR方法的可能性。现将该项技术的研究进展作一综述。

L AM P法的原理

该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,且可在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成,扩增效率高,可在15～60min扩增109～1010倍;特异性高,所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应用浊度仪检测沉淀浊度来判定的[2]。

1.引物的设计:基于靶基因3′端的F3c、F2c和F1c区以及5′端的B1、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。FIP引物:上游内部引物,由F2区组成,F2区与靶基因3′端的F2c区域互补,与靶基因5′端的F1c区域序列相同。F3引物:上游外部引物,由F3区组成,并与靶基因的F3c区域互补。B IP引物:下游内部引物,由B2区组成,B2区与靶基因3′端的B2c区域互补,与靶基因5′端的B1c区域序列相同。

B3引物:下游外部引物,由B3区域组成,和靶基因的B3c区域互补。

2.扩增原理:DNA在65℃左右处于动态平衡状态,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下,以FIP引物F2区段的3′末端为起点,与模板DNA互补序列配对,启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补,以3′末端为起点,通过链置换型DNA聚合酶的作用,一边置换先头FIP引物合成的DNA链,一边合成自身DNA,如此向前延伸。最终F3引物合成而得的DNA 链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链,这条单链在5′末端存在互补的F1c和F1区段,于是发生自我碱基配对,形成环状结构。同时,BIP引物同该单链杂交结合,以B IP引物的3′端为起点,合成互补链,在此过程中环状结构被打开。接着,类似于F3,B3引物从B IP引物外侧插入,进行碱基配对,以3′端为起点,在聚合酶的作用下,合成新的互补链。通过上述两过程,形成双链DNA。而被置换的单链DNA两端存在互补序列,自然发生自我碱基配对,形成环状结构,于是整条链呈现哑铃状结构。该结构是LAM P法基因扩增循环的起始结构。至此为止的所有过程都是为了形成L AM P法基因扩增循环的起点结构。LAM P 法基因扩增循环:首先在哑铃状结构中,以3′末端的F1区段为起点,以自身为模板,进行DNA合成延伸。与此同时,FIP引物F2与环上单链F2c杂交,启动新一轮链置换反应。解离由F1区段合成的双链核酸。同样,在解离出的单链核酸上也会形成环状结构。在环状结构上存在单链形式B2c,B IP引物上的B2与其杂交,启动新一轮扩增。经过相同的过程,又形成环状结构。通过此过程,结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构[2]。

3.L AM P扩增产物的检测:(1)荧光定量检测:利用S Y BR GreenⅠ荧光染料只与双链DNA小沟结合,当它与DNA双链结合时,发出较原先强800～

1000倍的荧光的原理,在一个体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。在核酸大量合成时, S Y BR GreenⅠ能自动掺入双链DNA,通过检测所产生的荧光强度,获取Ct值,比照标准曲线,可确定模板DNA的起始拷贝数。(2)副产物———焦磷酸镁的浊度检测:在核酸大量合成时,从dN TP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产生副产物2焦磷酸镁沉淀。反应方程式如下:(DNA)n21+dN TP =(DNA)n21+P2O742+2Mg2+=Mg2P2O7(沉淀),具有极高的特异性,只要用肉眼观察或浊度仪在400nm光下,检测沉淀浊度就能够判断扩增与否。

L AM P的应用及展望

1.传染性疾病的定性和定量检测:目前应用L AM P技术检测的病毒主要有:乙型肝炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、水痘2带状疱疹病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、SARS冠状病毒、呼吸道合胞病毒、西尼罗河病毒等。应用于细菌性疾病的检测主要有结核分支杆菌、痢疾志贺菌、大肠杆菌、螺旋体、肺炎链球菌和耶氏菌等。

对DNA病毒的检测:Enomoto等[3]及Kaneko 等[4]分别采用L AM P和聚合酶链反应(PCR)两种方法进行DNA扩增7型人类疱疹病毒的DNA,采用焦磷酸镁浊度检测法时,测得30min的L AM P反应的灵敏性为每管500拷贝,而60min的L AM P反应的灵敏性为每管250拷贝,其中仅底物为H HV27 DNA的反应中生成了L AM P产物,而在另外的底物为H HV26A DNA、H HV26B DNA、巨细胞病毒(HCMV)DNA的L AM P反应中均不能发现L AM P 产物。

对RNA病毒的检测:RNA逆转录两步法检测: Poo n等[5]采用PCR和L AM P来扩增甲型流感病毒的RNA,其中L AM P反应条件是在60℃的恒温下反应2h,而PCR实验中,反应需进行35次循环。每一反应结束后,以琼脂电泳分析法来测定各反应灵敏度:L AM P的灵敏度为10-3,较之与PCR的10-2要高;而且,L AM P分析法的实验结果与病毒学诊断完全一致。

RNA逆转录一步法检测:Hong等[6]采用R T2 L AM P和逆转录2聚合酶链反应(R T2PCR)分别来扩增SARS冠状病毒的RNA,R T2LAM P反应在63℃的恒温条件下进行60min,而R T2PCR反应条件较前者繁琐得多,简单步骤如下:将cDNA在42℃条件下进行30min,94℃2min,然后再作以下循环34次: 94℃30s,54℃30s,72℃30s;最后在72℃30min; R T2L AM P和R T2PCR的检测范围分别为0.01～104PFU和1～102PFU,即前者较后者灵敏性高100倍。若采用R T2LAM P分析法检验出13例阳性和46例阴性样本,而R T2PCR仅检测出6例阳性样本(其余为阴性)。

U shio等[7]采用R T2L AM P等多种方法来检验呼吸道合胞病毒(RSV)的RNA,最终反应结果为:采用R T2L AM P分析法,在50例样品中检测出47例阳性样品;若采用R T2PCR分析法则测出42例阳性样品;采用EIA检测出34例阳性样品;而若采用病毒分离法仅检测出29例阳性样品;另外,分别采用RSV R T2L AM P A法和RSV R T2L AM P B法可检测出RSV A型阳性25例,RSV B型阳性23例,其中有1例表现为双阳性。

对细菌性疾病的检测:主要有结核分支杆菌。Iwamoto等[8]根据gyrB基因序列针对结核分支杆菌、鸟分支杆菌和胞内分支杆菌的特异引物和16s核糖体RNA保守序列的分支杆菌属公共引物,用L AM P方法从痰标本中鉴定结核分支杆菌、鸟分支杆菌和胞内分支杆菌。其操作非常简单,仅将所有的反应物混合后63℃孵育,即可在反应试管中加入S Y BR GreenⅠ进行检测。如果含有扩增产物,反应混合物变绿;反之,则保持S Y BR GreenⅠ的橙色不变。L AM P从固体培养基中鉴定出特异的分支杆菌属所用时间为35min以内,而液体培养基则需60min。

对真菌的检测:南美牙生菌病(PCM)是一种由热依赖的二相真菌巴西类球孢子菌(PB)引起的疾病,高发于拉丁美洲国家,而在非流行地区,PB的诊断比较困难。PCR从真菌中检测出PB特异的基因(gp43和gp27等)需要5～6h,而血液或组织标本,则需要12h以上。用L AM P检测gp43基因仅需3h,因此L AM P在真菌检测中很有前景[9]。

2.L AM P的特点:L AM P法具有许多迄今为止的扩增方法所无法比拟的优点。(1)只需一恒定温度就能扩增反应。不需要特殊试剂,不需要预先进行双链DNA的变性。(2)高特异性:应用6个区段、4种引物,并且这6个区段的顺序也有规定。因此LAM P 法扩增的特异性很高,可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否,即能够进行细菌或病毒的定性检测。(3)快速、高效扩增:整个扩增在不到60min即可完成,且产率可达到0.5mg/ml。若在引物上再进一步改进,可大大提高其扩增效率,扩增时间在原来的基础上减少1/3～1/2。(4)灵敏度高:扩增模板可达1～10拷贝。(5)步骤简单:扩增RNA只要在DNA 基因扩增试剂的基础上加上逆转录酶,就能够完全像DNA基因扩增那样,一步实现RNA扩增。(6)鉴定简便:在核酸大量合成时,从dN TP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产生副产物———焦磷酸镁沉淀。它有极高的特异性,只要用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能够判断扩增与否。也可利用现有的荧光定量PCR仪作荧光定量检测。(7)缺点:LAM P法只能有两种结果:扩增和不扩增。靶序列长度控制在300bp以下,一旦产生(下转第1096页)