黄旭升)中国强直性肌营养不良1型患者的分子诊断

反应二原理
✓ 扩增反应早期P4结合到大等位基因三核苷酸重复序 列多个位点形成复合物
✓ P4耗尽后P3和复合物继续扩增，复合产物含5’荧光 ✓ 自动激光荧光测序仪使最终产物可视化，判断是否
有超过正常范围的CTG重复数
RNA-Fish
✓ 2006年Emanuela Bonifazi等报道用RNA-荧光原位杂交方法(RNA-Fish) 对DM1进行产前诊断
CTG重复数与表型关系
CTG重复数 5-35 （正常范围） 36-50 （前突变） 51-150（致病突变） >150 （致病突变）
重复序列状态 稳定 可能不稳定 不稳定 不稳定
表型 正常 无临床表现 轻型/经典DM1 经典/青少年型/先天型DM1
DM1——分子诊断的必要性
✓ 临床表现复杂，轻型、不典型或症状前者易漏诊或误诊 ✓ 鉴别诊断、筛查无症状家属 ✓ 正确分子诊断为研究发病机制奠定基础
临床分型
DM1
先天型DM1(congenital DM1)
青少年型DM1(juvenile DM1) 经典/成年发病型DM1 (classical/adult-onset DM1) 轻型DM1(mild DM1)
先天型DM1
✓ CTG重复数：730 - 4,300 ✓ 主要为母系遗传 ✓ 出生前可有羊水过多和胎动减少，出生发病或婴儿期发病 ✓ 严重全身无力，肌张力低，呼吸困难，足畸形等，肌强直不明显 ✓ 特征性倒‘V’字形上唇，称为帐篷或鱼嘴样上唇，主要由面肌无力引起 ✓ 较其它类型重，死亡率高；新生儿期过后病情可逐渐改善，发展为成年
1/500
5/100,000
0.46/100,000 Less common
Rare/absent
遗传基础
19q13.32 DMPK基因3’非翻译区 ( CTG )n 序列异常扩展 动态突变疾病 DM1: 50 - 4000 正常: 3-37
临床表现
骨骼肌：肌强直，肌无力，肌萎缩 心脏传导系统：心律失常 晶状体：白内障 内分泌系统：胰岛素抵抗，性腺功能减退 中枢神经系统：日间嗜睡，认知障碍
常用分子诊断方法
PCR & 片段长 度分析
Southern blot
TP-PCR
Smallpool PCR
RNAFISH
PCR & 片段长度分析
1. CTG重复数达4000以上，GC含量高，仅用于重复数较小（50-100左右）者 2. Southern blot前初筛 ① PCR产物出现两个正常电泳带，可除外DM1 ② 仅一条正常电泳带，需限制性内切酶对全基因组DNA酶切后行Southern blot，
型DM1；常伴智力低下、运动和语言发育迟缓、吞咽困难等
青少年型DM1
✓ 发病年龄较早 ✓ 突出表现：面肌无力常见，构音障碍、手肌强直和智能发育迟缓 ✓ 易漏诊：无明显神经系统异常及阳性家族史
经典DM1
✓ CTG重复数：100 - 1000
✓ 主要表现：成年起病，骨骼肌受累明显（肌强直、肌无力和肌萎缩） ✓ 骨骼肌受累多以远端为主 ✓ 多系统受累常见，其中白内障发生率最高
Triplet Repeat Primed PCR (TP-PCR)
1. 半定量检测法 2. 引物：P1（带5’荧光）、P2、P3、P4 CTG和P4 CAG 3. 反应一：引物P1和 P2，扩增DMPK基因CTG重复序列区域，稳定扩
增重复数100以下序列 4. 反应二：引物P1，P3，P4 ， 扩增重复数100以上序列 5. PCR产物：毛细管电泳，可视化分析
轻型DM1
✓ CTG重复数：50 - 1Байду номын сангаас0
✓ 临床表现轻微，仅轻度肌强直，肌无力、肌萎缩不明显 ✓ EMG可有肌源性损害 ✓ 部分检出白内障 ✓ 日间嗜睡可为主要表现
DM1——三核苷酸重复疾病 ( TRD )
动态突变：长度变异，即重复序列拷贝数 增加，也叫多态性突变
CTG
PCR
TP
大多数情况下，CTG重复数越小，临床症
发现超过正常范围异常带，确诊DM1
Southern blot
1. CTG重复数100以上，PCR无法可靠扩增重复片段 2. 全基因组DNA，限制性内切酶酶切，探针行Southern blot 3. 常用限制性内切酶：EcoRⅠ, BamHⅠ, NcoⅠ, BglⅠ 4. 常用探针：pGB2.6, pMDY1, cDNA25, p5B1.4
Southern blot & PCR
1. 检测所有DM1突变，无假阳性 2. 操作过程复杂，费时费力，一般实验室难以开展 3. 需大量基因组DNA 4. 目前国内获得商品化探针较难 5. Smear：由于存在体细胞嵌合，全基因组DNA行Southern blot在
电泳带中往往出现拖尾现象，准确计算CTG重复数困难
✓ 对DM1母亲绒膜绒毛取样培养细胞行RNA-Fish检测特征性细胞表型， 细胞核出现含突变DMPK基因转录本的局灶性包涵体
✓ CTG重复数大于200时，RNA-Fish方法在滋养层细胞分裂间期核中可有 效检测到特异的包涵体
国内现状
✓ 较长时间内没有建立DM1正确的分子诊断方法 ✓ 多限于病例报道，诊断也多局限于临床、电生理和肌肉活检 ✓ 2011年起，许多单位开始应用TP-PCR做DM1基因诊断
Small-pool PCR
1. 基因组DNA稀释，多个小池完成三核苷酸重复序列扩增 2. PCR产物由琼脂糖凝胶电泳分离，经Southern blot杂交检测 3. 准确定量重复片段长度变异，适于研究DM1患者CTG重复序列不稳定
性和体细胞嵌合现象 4. 操作难度大，过程繁琐，不适于常规基因诊断
中国强直性肌营养不良 1型患者的分子诊断研究
中国人民解放军总医院
神经内科 黄旭升
强直性肌营养不良1型 ( DM1 )
成人最常见遗传性神经肌肉病 常显遗传 隐袭起病，缓慢进展 临床异质性强，常合并多系统损害 死亡原因：呼衰、心律失常
患病率
地区、种族差异；平均 8-12/100,000
4/100,000
PCR
状越轻，发病年龄越大
遗传早现：后代患者CTG重复数更多，临床表 TRD 现更重，发病年龄更早
Southern blot
CTG重复数体细胞变异
✓ CTG序列突变频率高，易发生不稳定重复 ✓ 重复数每年可增加50-80个 ✓ 组织差异性：肌肉、心脏、肾脏最高；血中最低 ✓ 体细胞崁合：CTG重复数在成年期增加