48个X_SNP位点的筛选及法医学应用价值分析
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中国法医学杂志 CH IN J FO REN S IC M ED
2010 年第 25 卷第 1 期
48个 X SNP 位点的筛选及法医学应用价值分析
畅晶晶 , 李
( 1 复旦大学上海医学院法医学系 , 上海 医学重点实验室 , 上海 摘要 目的
1 , 2
莉 , 张素华
2
2 , 3
200032; 2 司法部 司法鉴定科学技术研究所 上海市法 苏州 215123) 根据 NCB I和 H ap
2
检验 , 结 果 显 示群 体 处 于
H ardy W e inberg 平 衡 状 态 ; 应 用 Pow er M arker V3 25 按位点在染色体上的位置两两顺次检验后发现 |D | 大于 0 8的位点对有 2 组, 应用 S NPAnalyzer2 0 对任 意两位点间连锁不平衡关系进行检验后发现 , 在 946 次比较中 , |D |大 于 0 5 的位点组有 76 对 , 大于 0 8 的有 15对 ; r 大于 0 06 的有 256 对 , 大于 0 11 的有 128 对, 连锁不平衡 检验的 P 值小 于 0 05 的有 149 对, P 值小于 0 01 的有 64对 , 检见单倍域 1 个 ( 由位 点 rs6527549 和 rs183277 构成 ), 具体数据略 ; 位点的 杂合度 (HET )、 多态性信息含量 ( P IC ) 、 女性群体个 体识 别 能 力 ( DP fem ale ) 、 男 性 群体 个体 识 别能 力 ( DP m a le ) 、 二联体平均排除率 ( PE duo ) 和三联体平均排 除率 ( PE trio )等数据见表 2。
2 TM T M
2 结
果
[ 1]
经过初筛共从 H ap M ap 网上信息中选出符合标准 的位点 167个 , 从中优化得到符合实验设计标准的 TM 48X SNP 位点组 , 位点相关信息见表 1 。应用 SNP lex Syste m 对 200份样本分型, 采用直接计数法统计出各 位点等位基因频率后可知, 48 个位点中两性样本等位 基因频率间未发现存在显著性差异 ; 与 NCB I网站数据 比较后发 现中国 华东 地区 汉族人 群在 rs10855633 、 rs17264553、 rs5916781 、 rs5927322 、 rs5989571 和 rs6527549 六个位点的频率数据与网站频率数据之间 存在显著性差异 , P < 0 05 , 其余 42 个位点的比较未 发现统计学上的差异, 具体数据略; 对女性群体样本 的等位 基因 频率 进行
位点逐渐成为法医生物学研究的焦点。本文实验以 X 染色体上的 SNP 位点为研究对象, 尝试在 SNP lex System 技术的基础上建立起适用于中国汉族人群的 X S NP 分型系统 , 从而满足当前仅依靠常染色体 STR 分型无法完成的特殊类型亲缘关系鉴定的需要 , 并可 以作为常规遗传标记检测系统的辅助手段。
基金项目 上海市 自然科 学基 金项 目 ( 08ZR 1419800); 科 研 院所社会公益研究专 项项目 ( GY0805) 作者简介 畅 晶 晶 , 女 , 硕 士 , 主 要 从 事 法 医 生 物 学研 究。 E ma i: l janychangcs@ i 163 co m 通讯作者 李莉 , 女 , 研 究员 , 硕士 生导 师 , 主要 从事 法医 生 物学研究。 E ma i: l anne inchina @ 163 com
1, 2 2
Selection and evaluation of forensic app lication value of 48 X SNP loci ( CHANG Jin g jing , L I L i, 2, 3 ZHANG Suhua /1 D epart m ent of F orensicM ed icin e, ShanghaiM ed ical Co llege, Fudan University, Shanghai 200032 , China; 2 Shanghai K ey Laboratory of F orensic M edicine, Institute of Forensic S cience, M inistry of Justice, P. R. China, Shanghai 200063 , China; 3 M ed ical School of Soochow University, J ia ng su Suzhou 215123 , China ) Ab stract Objectiv e To analyze and evalu ate the 48 selected h ig hly polym orphic SNP loci in Ch in ese H an popu la t io n on genetic and forensic aspects . M ethod s Sam ples from 200 unrelatedH an ind iv idua ls in East China w ere collected . 48 X SNP po lym orph ic genetic m arkers w ere selected accord in g to the in form ation TM prov id edby NCBI and H ap M ap , and then w ere typed by SNP lex Syste m for estab lishing genetic data . R esults T he 48 X SNP loci w ere h ig hly polym orphic m arkers in East Ch in aH an popu lation except rs6527549 , and their po lym o rph ism in form ation contents ( P IC ) w ere all above 0 32, the discri m in ation pow er ( DP ) in fem ales and m alesw ere above 0 56 and 0 40 respectively , th e probab ility o f ex clu sio n ( PE ) in duos and trios w ere above 0 20 and 0 32 respectively . In add ition, linkage d isequilib riu m sw ere observed am ong som e lo c.i Conc lu sion T he 48 X SNP loci union is su itab le for deve lop ing high throughou t autom ated research and also useful for spec ial parentage testin g . K ey w ord s fo rensic bio lo gy; genetic po lym orphism; SNP lex; sin gle nucleotide polym orphism; linkage d isequilib rium 遗传标记的检验效力是法医生物学研究的一项 重要内容, 随着常染色体 STR 基因座突变率的增高 , 具有含量丰富、 分布广泛且遗传稳定性高等特点的单 核苷酸多态性 ( sin gle nucleotide po lym orphism, SNP )
T M
百度文库
AB I7500 荧 光 定 量 仪, AB I9700PCR 扩 增 仪 , AB I3130遗传分析仪 ; Chelex 100 , 酚 /氯 仿, SNP lex System 试剂。 1 2 方法 1 2 1 位点筛选 根据 H ap M ap提供的信息, 从 X 染色体端粒部分 起 , 在内含子区内以 20Kb 为标尺按 SNP 位点的饼图 分布情况进行筛选, 要求低分布的等位基因频率在中 国汉族人群中大于 0 3 , 优先选择等位基因对等分布 的 SNP位点; 对位点进行序列同源性检查后根据其在 X 染色体上的位 置分散选 择, 尽 量保证位 点分布均 衡。最后利用美国应用生物系统网站提供的实验设 计辅助工具 自动实验设计线对选出的位点进行 比对 优化 , 得出 符 合 实验 设 计 标 准的 48X SNP 位 点组。 1 2 2 基因组 DNA 的制备 由于 SNP lex System 对 DNA 模板的要求较为严 格 , 为得到高纯度、 高浓度的基因组 DNA, 本实验采用 常规 Chelex 100 法与有机法相结合的方法抽提基因 组 DNA。 1 2 3 位点分型与检测 SNP lex System 技术是基 于复合 扩增和 荧光标 记 技术的 一种以 寡核苷 酸连 接反应 为特点 的新型 SNP 检测技术。该技术通过对模板 DNA 的片段化处 理 , 使之 产 生 符 合连 接 反 应 要 求 的 DNA 片 段; 在 d AT P存在的条件下, 连接酶将模板 DNA 片段、 连接 部分及探针部分通过磷酸二酯键连接生成一条半闭 环结构的寡核苷酸链 ; 再经酶切处理得到纯化的模板 DNA 连接产物 ; 将连接产物作为 PCR 反应的模板在 单向标记有生物素的通用引物作用下进行复合扩增 ; 扩增产物与固定有链酶素亲和素的杂交板进行杂交 后洗脱 ; 以可与 连接产物中等 位基因特异 性探针上 Z ipCode序列严格互补的 Z ipChute 探针与杂交板上固 定的扩增产物杂交; 在除去多余探针后将杂交成功的 探针洗脱下来进行毛细管电泳 ; 通过 Gene M apper4 0 软件进行分型检测。 1 2 4 数据统计分析 根据分型结果分别计算 48 个 X SNP 位点各等位 基因频率、 杂合度、 多态性信息含量、 个体识别能力、 非父排除率等遗传学参数 , 对男女性群体等位基因频 率进行方差齐性检验。应用
200063; 3 苏州大学基础医学 院 , 江苏
对筛选出的 48 个 X SN P位点进行遗传学分析 , 评价其 法医学应用 价值。 方法
M ap 网站提供的位点信息筛选出 48 个高信息量 X SNP 位点 , 利用 SNP lexTM Syste m 技术 平台进行 分型检测 , 通过 中国华 东地区汉族人群 200 个无关个体的调查建立遗传学资料 , 对 48 个 X SNP 位点的 遗传多态性 进行研究分 析 , 并 进行连锁 不平衡检验。 结果 除 rs6527549 外 , 筛选出的 48 个 X SN P 位点在 中国华东 汉族人 群中具 有高信 息量 , 多态信 息含量 本实 验选取的 48 个 X SN P 位点分 型结果稳 定 , 均在 0 32 以上 , 个体识别率在女性群体和男性群体分别为 0 56 和 0 40 以上 , 非 父排除率 在二联 体和三 联体中 分别为 0 20 和 0 32 以上。检验发现 , 部分位点存在连锁不平衡现 象。 结论 重复性好 , 在法医生物学研究中具有较高的应用价值 , 适于开展大规模的高通量检测。 关键词 法医物证学 ; 遗传多态性 ; SNP lex ; 单核苷酸多态性 ; 连锁不平衡 文献标识码 A 文章编号 1001- 5728( 2010) 01- 0006- 05
TM
1 材料与方法
1 1 材料 1 1 1 样本 200份来自健康志愿者的全血样本, 男女比例 1 : 1 ,
6
中国法医学杂志 CH IN J FO REN S IC M ED 每份 1mL, 以枸橼酸钠抗凝。 1 1 2 主要仪器及试剂
2010 年第 25 卷第 1期
和 SNPAna ly zer2 0 群体遗传学软件对位点间是否存 在连锁不平衡状态进行分析
2010 年第 25 卷第 1 期
48个 X SNP 位点的筛选及法医学应用价值分析
畅晶晶 , 李
( 1 复旦大学上海医学院法医学系 , 上海 医学重点实验室 , 上海 摘要 目的
1 , 2
莉 , 张素华
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2 , 3
200032; 2 司法部 司法鉴定科学技术研究所 上海市法 苏州 215123) 根据 NCB I和 H ap
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检验 , 结 果 显 示群 体 处 于
H ardy W e inberg 平 衡 状 态 ; 应 用 Pow er M arker V3 25 按位点在染色体上的位置两两顺次检验后发现 |D | 大于 0 8的位点对有 2 组, 应用 S NPAnalyzer2 0 对任 意两位点间连锁不平衡关系进行检验后发现 , 在 946 次比较中 , |D |大 于 0 5 的位点组有 76 对 , 大于 0 8 的有 15对 ; r 大于 0 06 的有 256 对 , 大于 0 11 的有 128 对, 连锁不平衡 检验的 P 值小 于 0 05 的有 149 对, P 值小于 0 01 的有 64对 , 检见单倍域 1 个 ( 由位 点 rs6527549 和 rs183277 构成 ), 具体数据略 ; 位点的 杂合度 (HET )、 多态性信息含量 ( P IC ) 、 女性群体个 体识 别 能 力 ( DP fem ale ) 、 男 性 群体 个体 识 别能 力 ( DP m a le ) 、 二联体平均排除率 ( PE duo ) 和三联体平均排 除率 ( PE trio )等数据见表 2。
2 TM T M
2 结
果
[ 1]
经过初筛共从 H ap M ap 网上信息中选出符合标准 的位点 167个 , 从中优化得到符合实验设计标准的 TM 48X SNP 位点组 , 位点相关信息见表 1 。应用 SNP lex Syste m 对 200份样本分型, 采用直接计数法统计出各 位点等位基因频率后可知, 48 个位点中两性样本等位 基因频率间未发现存在显著性差异 ; 与 NCB I网站数据 比较后发 现中国 华东 地区 汉族人 群在 rs10855633 、 rs17264553、 rs5916781 、 rs5927322 、 rs5989571 和 rs6527549 六个位点的频率数据与网站频率数据之间 存在显著性差异 , P < 0 05 , 其余 42 个位点的比较未 发现统计学上的差异, 具体数据略; 对女性群体样本 的等位 基因 频率 进行
位点逐渐成为法医生物学研究的焦点。本文实验以 X 染色体上的 SNP 位点为研究对象, 尝试在 SNP lex System 技术的基础上建立起适用于中国汉族人群的 X S NP 分型系统 , 从而满足当前仅依靠常染色体 STR 分型无法完成的特殊类型亲缘关系鉴定的需要 , 并可 以作为常规遗传标记检测系统的辅助手段。
基金项目 上海市 自然科 学基 金项 目 ( 08ZR 1419800); 科 研 院所社会公益研究专 项项目 ( GY0805) 作者简介 畅 晶 晶 , 女 , 硕 士 , 主 要 从 事 法 医 生 物 学研 究。 E ma i: l janychangcs@ i 163 co m 通讯作者 李莉 , 女 , 研 究员 , 硕士 生导 师 , 主要 从事 法医 生 物学研究。 E ma i: l anne inchina @ 163 com
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Selection and evaluation of forensic app lication value of 48 X SNP loci ( CHANG Jin g jing , L I L i, 2, 3 ZHANG Suhua /1 D epart m ent of F orensicM ed icin e, ShanghaiM ed ical Co llege, Fudan University, Shanghai 200032 , China; 2 Shanghai K ey Laboratory of F orensic M edicine, Institute of Forensic S cience, M inistry of Justice, P. R. China, Shanghai 200063 , China; 3 M ed ical School of Soochow University, J ia ng su Suzhou 215123 , China ) Ab stract Objectiv e To analyze and evalu ate the 48 selected h ig hly polym orphic SNP loci in Ch in ese H an popu la t io n on genetic and forensic aspects . M ethod s Sam ples from 200 unrelatedH an ind iv idua ls in East China w ere collected . 48 X SNP po lym orph ic genetic m arkers w ere selected accord in g to the in form ation TM prov id edby NCBI and H ap M ap , and then w ere typed by SNP lex Syste m for estab lishing genetic data . R esults T he 48 X SNP loci w ere h ig hly polym orphic m arkers in East Ch in aH an popu lation except rs6527549 , and their po lym o rph ism in form ation contents ( P IC ) w ere all above 0 32, the discri m in ation pow er ( DP ) in fem ales and m alesw ere above 0 56 and 0 40 respectively , th e probab ility o f ex clu sio n ( PE ) in duos and trios w ere above 0 20 and 0 32 respectively . In add ition, linkage d isequilib riu m sw ere observed am ong som e lo c.i Conc lu sion T he 48 X SNP loci union is su itab le for deve lop ing high throughou t autom ated research and also useful for spec ial parentage testin g . K ey w ord s fo rensic bio lo gy; genetic po lym orphism; SNP lex; sin gle nucleotide polym orphism; linkage d isequilib rium 遗传标记的检验效力是法医生物学研究的一项 重要内容, 随着常染色体 STR 基因座突变率的增高 , 具有含量丰富、 分布广泛且遗传稳定性高等特点的单 核苷酸多态性 ( sin gle nucleotide po lym orphism, SNP )
T M
百度文库
AB I7500 荧 光 定 量 仪, AB I9700PCR 扩 增 仪 , AB I3130遗传分析仪 ; Chelex 100 , 酚 /氯 仿, SNP lex System 试剂。 1 2 方法 1 2 1 位点筛选 根据 H ap M ap提供的信息, 从 X 染色体端粒部分 起 , 在内含子区内以 20Kb 为标尺按 SNP 位点的饼图 分布情况进行筛选, 要求低分布的等位基因频率在中 国汉族人群中大于 0 3 , 优先选择等位基因对等分布 的 SNP位点; 对位点进行序列同源性检查后根据其在 X 染色体上的位 置分散选 择, 尽 量保证位 点分布均 衡。最后利用美国应用生物系统网站提供的实验设 计辅助工具 自动实验设计线对选出的位点进行 比对 优化 , 得出 符 合 实验 设 计 标 准的 48X SNP 位 点组。 1 2 2 基因组 DNA 的制备 由于 SNP lex System 对 DNA 模板的要求较为严 格 , 为得到高纯度、 高浓度的基因组 DNA, 本实验采用 常规 Chelex 100 法与有机法相结合的方法抽提基因 组 DNA。 1 2 3 位点分型与检测 SNP lex System 技术是基 于复合 扩增和 荧光标 记 技术的 一种以 寡核苷 酸连 接反应 为特点 的新型 SNP 检测技术。该技术通过对模板 DNA 的片段化处 理 , 使之 产 生 符 合连 接 反 应 要 求 的 DNA 片 段; 在 d AT P存在的条件下, 连接酶将模板 DNA 片段、 连接 部分及探针部分通过磷酸二酯键连接生成一条半闭 环结构的寡核苷酸链 ; 再经酶切处理得到纯化的模板 DNA 连接产物 ; 将连接产物作为 PCR 反应的模板在 单向标记有生物素的通用引物作用下进行复合扩增 ; 扩增产物与固定有链酶素亲和素的杂交板进行杂交 后洗脱 ; 以可与 连接产物中等 位基因特异 性探针上 Z ipCode序列严格互补的 Z ipChute 探针与杂交板上固 定的扩增产物杂交; 在除去多余探针后将杂交成功的 探针洗脱下来进行毛细管电泳 ; 通过 Gene M apper4 0 软件进行分型检测。 1 2 4 数据统计分析 根据分型结果分别计算 48 个 X SNP 位点各等位 基因频率、 杂合度、 多态性信息含量、 个体识别能力、 非父排除率等遗传学参数 , 对男女性群体等位基因频 率进行方差齐性检验。应用
200063; 3 苏州大学基础医学 院 , 江苏
对筛选出的 48 个 X SN P位点进行遗传学分析 , 评价其 法医学应用 价值。 方法
M ap 网站提供的位点信息筛选出 48 个高信息量 X SNP 位点 , 利用 SNP lexTM Syste m 技术 平台进行 分型检测 , 通过 中国华 东地区汉族人群 200 个无关个体的调查建立遗传学资料 , 对 48 个 X SNP 位点的 遗传多态性 进行研究分 析 , 并 进行连锁 不平衡检验。 结果 除 rs6527549 外 , 筛选出的 48 个 X SN P 位点在 中国华东 汉族人 群中具 有高信 息量 , 多态信 息含量 本实 验选取的 48 个 X SN P 位点分 型结果稳 定 , 均在 0 32 以上 , 个体识别率在女性群体和男性群体分别为 0 56 和 0 40 以上 , 非 父排除率 在二联 体和三 联体中 分别为 0 20 和 0 32 以上。检验发现 , 部分位点存在连锁不平衡现 象。 结论 重复性好 , 在法医生物学研究中具有较高的应用价值 , 适于开展大规模的高通量检测。 关键词 法医物证学 ; 遗传多态性 ; SNP lex ; 单核苷酸多态性 ; 连锁不平衡 文献标识码 A 文章编号 1001- 5728( 2010) 01- 0006- 05
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1 材料与方法
1 1 材料 1 1 1 样本 200份来自健康志愿者的全血样本, 男女比例 1 : 1 ,
6
中国法医学杂志 CH IN J FO REN S IC M ED 每份 1mL, 以枸橼酸钠抗凝。 1 1 2 主要仪器及试剂
2010 年第 25 卷第 1期
和 SNPAna ly zer2 0 群体遗传学软件对位点间是否存 在连锁不平衡状态进行分析