分子信标的研究及应用

分子信标的研究及应用

90413118 马晓雯

90413129 李艳丽

90413130 鲁涛

90413123 蒋昱萌

【关键词】：

分子信标分子信标原理生物传感器分子信标应用：实时荧光PCR

【摘要】：

分子信标是一种基于荧光共振能量转移原理设计的一种新型核酸荧光探针，其与靶序列结合会发生结构的变化从而影响荧光信号。因其检测具有高灵敏、高特异性，并且可用于活体的实时检测，因而被广泛的应用于生化分析，生物医学等很多领域。本文主要就分子信标的工作原理和应用进行介绍。

1、引言

分子信标是一种可以特异识别核酸序列的新型荧光探针，这种荧光探针是通过与核酸靶分子进行杂交后构象发生变化而发出荧光的。这项技术是Sanjay Tyagi于1996年首次发明的[1]，因其具有背景信号低、灵敏度高、特异性识别性强、操作简单以及不必与未反应的探针分离即可实时检测等优点,在短短的几年内得到了迅速的发展,并已广泛地应用于实时监测聚合酶链反应、基因突变的快速分析、ＤＮＡ、ＲＮＡ的检测、ＤＮＡ/ＲＮＡ杂交的动力学研究以及ＤＮＡ/蛋白质相互作用研究等,其应用领域仍在不断拓展。

2、原理

2．1分子信标的结构

分子信标属于单链寡核苷酸探针,其巧妙之处在于独特的茎环状结构(也称发夹型)。分子信标的设计一般包括三个部分:

(1)环状区：一般为长度为15～30个碱基的序列,其通过与待测核酸链互补结合,从而与目标分子特异结合;

(2)茎干区：通常为长度为5～8个碱基的互补序列,茎干区与杂交后环状区-目标分子的双链结构之间的热力学平衡关系,使分子信标的杂交特异性明显高于常规的线状探针;

(3)荧光基团和猝灭基团：荧光基团一般联接在信标分子的5’-端;猝灭基团联接在3’-端。常用4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)作为猝灭基团,德克萨斯红(TexasRed)、荧光素(Fluoresein)等作为荧光基团。（图1为经典分子信标结构）

[10]

2．2工作原理

当靶序列不存在时,分子信标茎干区特异结合形成发夹结构,茎部的荧光分子与淬灭分子非常接近(7～10ｎｍ), 当受到激发光激发时, 荧光基团发出荧光;由于淬灭分子吸收光谱与荧光基团的荧光发射光谱重叠,因此可发生荧光共振能量转移（FRET）[2],即荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发,此时荧光背景极低检测不到荧光信号;当有靶序列存在时,分子信标的环序列与互补靶序列特异性结合, 形成相对刚性并且更加稳定的异源双链杂交体，此时荧光分子与淬灭分子分开,二者之间的空间距离增大, 根据Foerster理论, 中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，所以荧光分子发出的荧光不能被淬灭分子吸收,荧光几乎100%恢复，从而可检测到荧光。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。

[13]

2．3分子信标的标记

通常分子信标都只修饰一个单一的发光基团，所以在一个均相体系中,通过杂交后荧光信号的变化,一种分子信标只可检测一种靶序列。为了在一个均相体系中同时检测多种靶序列,可以将不同的分子信标修饰以不同的荧光基团。例如,Tyagi等利用四种不同的分子信标进行等位基因检测。这四个信标分子环状区同一位置只有一个碱基组成不同,所连接的荧光基团则分别具有不同的激发波长和发射波长。将这四种分子信标等量混合放入四个试管中,并分别加入靶序列。只有与靶序列完全匹配的分子信标才能发生特异性结合,并在相应激发波长下发射出荧光。但应用这种方法,不同的荧光基团需要不同波长的激发光激发，且发射的荧光也不同，所以需要根据具体的荧光基团采用不同波长的激发光源和在不同的特定波长处采集相应的荧光信号，相对测定比较困难。

为了采用单一激发光源,Tyagi等在发明了传统的分子信标后,又设计了一种荧光波长转移型分子信标(图3),这种分子信标的一末端连接两个不同的荧光基团:荧光收集基团(harvesting fluorophore)和荧光发射基团(emitting fluorophore),分子信标的另一末端连接猝灭基团。未结合靶分子时,它与传统的分子信标一样,荧光收集基团吸收的能量传给猝灭基团,然后能量以热的形式放出,不产生荧光;当与靶分子结合发生构象变化后,荧光收集基团的荧光并未恢复,而是把能量以荧光共振能量转移的形式转移给荧光发射基团,荧光发射基团将能量以荧光的形式放出，在单一光源激发下,荧光发射基团可在可见光谱区发出不同波长的荧光。这样可以通过选择不同波长的荧光发射基团,从而使分子信标按设计的要求发出不同颜色的荧光。[4]

（图3）

2．4分子信标的表面固定

最初设计的分子信标只能在均相溶液中检测靶分子,因而极大地限制了它在生物医学及DNA生物传感器上的应用。为了解决这一问题, 1999年谭蔚泓等首次通过生物素-抗生物素蛋白将分子信标固定在光纤表面,然后将光纤浸入含需检测的靶序列的溶液中,同时由光纤导入激光,从而实现单分子检测。在生物素化的分子信标的合成上,为了使引入的生物素对分子信标杂交的影响降到最低，生物素基团被连接到干部分猝灭基团的一侧。他们用这种可固定化的分子信标进行了ＤＮＡ杂交的动力学研究,并发现其对DNA的检测灵敏度可以达到nmol级。

另一种方法是将分子信标的猝灭基团连接到一个CPG (controlledporeglass)球上，此方法也可以实现分子信标在CPG上的固定。[13]

固定分子信标的方法为分子信标生物传感器及分子信标生物芯片的研究奠定了基础,使分子信标更广泛地应用于生物体系。但同时研究也发现,固定化对分子信标的空间结构具有一定影响,使得荧光猝灭不完全,以致初始状态荧光背景较强。造成这种现象的原因,可能是分子信标一端被固定后,其空间运动自由度减少,致使被固定的一端不能自由运动,此时猝灭基团与荧光基团的靠近可能需要越过较高的能垒,妨碍了二者的靠近,使得猝灭不完全而背景增高。研究结果表明,在载玻片表面修饰一层琼脂糖凝胶薄膜,可为固定在其中的分子信标提供一个近似液相的环境,使其自由度增加，从而有效地解决了因分子信标直接固定在玻璃表面引起的背景增高现象，使生物传感器技术得到大大的改善。

（分子信标MB1与靶序列完全不匹配;MB2与靶序列完全匹配；

MB3、MB4、MB5与靶序列但碱基错配）

2．5影响分子信标的主要因素

分子信标中荧光-猝灭基团间的距离是影响分子信标性质的最主要因素。根据Foerster 理论,荧光能量转移效率与荧光-猝灭基团间距离的6次方成反比。与靶序列杂交后,荧光基团受激产生的荧光无法继续被猝灭基团吸收,分子信标荧光恢复。有文献报道,杂交后分子信标的荧光强度一般可增加数十倍甚至百倍。

结构方面的因素。在进行分子信标的研究和应用时, 设计茎干区和环状区的序列是关键。序列长度方面,通常探针序列比茎干区序列长两倍以上,以确保杂交引起分子信标结构的改变,使得杂交后荧光基团与猝灭基团之间距离足够远而不再发生猝灭现象。过长的茎干会使发夹结构过于稳定而给出假阴性结果,过短则发卡结构不稳定,易给出假阳性结果。序列碱基方面,为使茎干区稳定状态适当,环状区应该避免任何可能的二级结构,否则分子信标茎-环结构将受到影响。[10]

另外靶序列的浓度也是影响分子信标的主要因素。浓度较高时，被打开的分子信标越多，同时，茎环结构中的环序列与互补靶序列结合能力越强，荧光信号越强，影响物质的测定。[9]

温度是影响分子信标的另一个重要因素。研究表明分子信标在温度较低时可以保持稳定的发夹结构,较高的温度会破坏稳定的发夹结构,甚至使其伸展为随机线状,此时荧光基团与