农杆菌介导转化法

Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤 外， 还具有以下几种重要功能：
赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力； 赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力； 根癌农杆菌的寄主植物范围； 决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分； 参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素 的代谢活.
1) Ti质粒的结构 来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生
因的表达，当VirD操纵元的被诱导表达后，其中的VirD1和 VirD2蛋白质具有核酸内切酶的活性(Yanofsky M．F. 1986)， 能够在T-DN A边界重复序列的特异位点切开T-DNA单链，因此 T-DNA往往以单链形式进入植物细胞。但是在植物细胞中也发 现双链T-DNA分子。
切刻位点(nick site)可作为DNA从5’向3'合成的起始位 点，新的DNA链合成后，T-DNA单链即被替换 (displacement)释放出来(图2)。当然这种缺刻也可通 过重组系统把T-DNA双链从Ti质粒上解离下来。
的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类 胭脂碱(nopaline)类 农杆碱（agropine） 类。
Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应 基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达， 它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分 解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源 和碳源。
T-DNA 区域中的 这 些 基因只有在T-DNA插入 到植物基因组后才能激 活表达. 植物生长素和细胞分裂 素,可调节植物细胞的生 长和发育,它们的过量表 达刺激植物细胞大量快 速增长而形成冠瘿。
冠瘿碱也是在细胞内合 并成分泌出来的,构成根 癌农杆菌生长所须的碳 源和氮源.
Vir区
Vir区（Vir-region），即毒性区，其长度约为35kb。 它们控制根癌农杆菌附着于植物细胞和Ti质粒进入细胞 有关部位，与感染后冠瘿形成有关。Vir区位于T-DNA
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们 将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的 感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来， 农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也 得到了广泛应用。
农杆菌介导转化法
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌， 它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
农杆菌 感染柳树
产生 冠瘿瘤
原理： 根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri
质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口 进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
virE2蛋白是单链TDNA结合蛋白。可使 T-DNA形成1个细长的 核酸蛋白复合物（T复合体），以此保护 T-DNA不被包内外的 核酸酶降解。
最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接 受环境中的信号分子。 在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状 态，进而激活vir区其他基因表达。 其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为 松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使 单链T-DNA得以释放。 VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的 核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。 T-复合体依次穿过根癌农杆菌和植物细胞膜及细胞壁。并进入植物细胞核，最终 整合进入植物核基因组。 T-DNA的转移机理比较复杂，依赖于T-DNA区和vir区共同参与，涉及多个基因表 达及一系列蛋白质和核酸的相互作用。
长度：160-250 kb 6大功能区： 1)致癌区，这个区主要合成植物
生长素和细胞分裂素； 2)冠瘿碱合成区； 3)冠瘿碱分解区； 4)Ti质粒接合转移区(tra)； 5)毒性区（Vir）； 6)DNA复制区（Rep）。
T-DNA
在致癌区和冠瘿碱合成区的两侧 存在着一个24 bp直接重复序列， 由这三部分所构成的DNA区域叫 做T-DNA， 插入植物染色体中的Ti质粒片段 只有T-DNA。 由于T-DNA插入植物细胞染色体 中的位置不相同的，因此植物染 色体上可能并没有可供T-DNA插 入的专一性DNA序列。
经磷酸化由非活性态变为
活化状态，进而激活vir区
其他基因表达。
virA基因——virG基因
其中virD基因产物
virD1蛋白是一种DNA 松弛酶，它可使DNA 从超螺旋型转变为松
弛型状态；而virD2蛋
白则能切割已呈松弛 态的T-DNA，2个边界 产生缺口，使单链TDNA得以释放。
VirE基因所表达的
1981年，Ooms et al.发现Ti质粒上有致瘤区(virulence region)，Vir区。
Ti质粒
Ti质粒是根癌农杆菌 细胞核外存在的一种 环状双链DNA分子， 长度约200kb，平均 周长54.1－75 .4 um， 分子质量为（90－ 150）×106 Da。在温 度低于30℃的 条件下， Ti质粒可稳定地存在 于根癌农杆菌细胞内。
子的刺激，Ti质粒vir区毒性
基因被激活和表达。
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。 其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰 丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没 食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟 基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。
区左侧，包含义个毒性遗传点（virA、virＢ、virC、 virＤ、virＥ和virG）。
vir基因的控制着Ｔ－ＤＮＡ的转移。
virＥ virＤ virC virG virＢ virA
植物细胞受伤后，细胞壁破 裂，分泌物中含有高浓度的 创伤诱导分子（酚类化合 物）：如乙酰丁酮 （acetosyringone，AS）和 α-羟基酰丁香酮（αhydroxacetosyringone， OH-AS）。 根癌农杆菌对这一类物质具 有趋化性，在植物细胞表面 附着后，受这些创伤诱导分
双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子， 而使T- DNA可以成功的转入； 而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区的 基因，达到转基因的目的。
最先激活表达的是virA基
因，它编码感受蛋白，位 于细菌细胞膜的疏水区， 可接受环境中的信号分子。 在virA蛋白的激活下，
virG基因表达，virG蛋白
VirE
2.0
2
7, 60.5
C/M?
single-strand DNA-binding protein (VirE2)
virB
9.5
11
26,12,11,87,23,32, 5.5,25,32,48,38
M
T-DNA transfer apparatus?
T-DNA加工和转移 Vir基因表达调控的问题，知道VirA和VirG基因诱导其它Vir基
almost any type of tissues or cells 4. Mostly widely used system ,both monocot and dicot 5. Easy in manipulation ,
Disadvantages 1. Only good for nuclear transformation 2. Limited in host range,genotype-dependent 3. Detrimental to some tissues
4.5
4
16,47,21,75
C C/M?
transcriptional activator
T-DNA border endonuclease (VirD1 and VirD2); pilot protein? nuclear localization?(VirD2)
VirC
2.0
2
26,23
C?
processing of T-DNA(VirC1)
缺失研究也表明：右边界重复序列缺失后，T-DNA不能转移， 而左边界重复序列的缺失会稍稍降低T-DNA转移频率 (Timmerman B．1988)，这进一步说明T-DNA单链是在从右 边界到左边界5’向3‘替换合成中释放出来的。
右边界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不 能释放，所以T-DNA不能转移到植物细胞。而左边界的 缺失，仅会影响DNA合成过程的终止，可能会降低导致 T-DNA单链释放，而不会明显影响T-DNA单链的形成。
1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 (tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP
1977年，Chilton et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。
Table1 Summary of vir Gene Products
Locus
Size(kb)
ORFsa
Proteins Size(kDa) Locationb
Function
Βιβλιοθήκη Baidu
virA
2.0
1
90
M
plant signal sensor, protein kinase
VirG
1.0
1
30
VirD
脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中TDNA的左右两侧是一段24bp 的重复序列,构成T-DNA的边 界序列(border sequence), 分别称为左边界(left border,LB)和右边界(right border,RB).在某些章鱼碱型 根癌农根癌农杆菌Ti质粒中TDNA是以两个分开的独立片 段形式存在，即T-DNA左边 区段和T-DNA右边区段。研 究表明，插入在T-DNA边界 序列之间的任何DNA都可被 转到植物染色体中。因此Ti质 粒可用做外源目的基因的载 体。
• Types A.tumefaciens : the causative agent of plant disease crowng gall. A. rhizogenes : provokes hair roots.
冠瘿碱分解区
冠瘿也是在冠 瘿碱胞内合并 成分泌出来的, 被冠瘿碱分解 基因分解成根 癌农杆菌生长 所须的碳源和 氮源。
Agrobacterium-mediated transformation
Advantages: 1. Cleaner inserts 2. Higher co-expression 3. More flexible in tissue types(in planta transformation)
Introduction to Agrobacterium Moloecular mechanisms of T-DNA transfer into the plant genome Factors influencing the T-DNA delivery Regeneration and selection of transgenic plants
Story 冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面
的根茎交界处，形似帽状而得名。 1907年， Smith & Townsent 农杆菌诱发冠瘿瘤病。 1947年， Braun et al. 证实俩者的关系，但发现有的菌株不
致病。提出了假说：tumour-inducing principle,TIP.肿瘤 诱导因子 。 60’s , 肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine , nopaline） 总称冠瘿碱（opine) 。 Petit et al.证实肿瘤组织 合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用 冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了TIP)