鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化 26

操作：用粗蛋清溶液进行分离纯化,可使溶菌酶的纯度提高16～20倍, 达到0.62～0.76 mg/mg蛋白,这种亲和反胶团系统可以重复使用三次, 加入聚氧乙烯(120)去水三梨糖醇三油酸酯(Tween85)作为辅助表面 活性剂可以提高反胶团系统的容量。在pH9.16的前水相中,使用含有 Tween85(20 g/L)的反胶团可以使溶菌酶的产率超过70%。为了进一 步提高反微团萃取分离的选择性,可在反微团表面活性剂的烷基连接对 待分离蛋白质具有生物专一性的配基,实现反微团亲和萃取分离。
五、方法改进
方法：反胶团萃取
原理：当表面活性剂溶于大量与水不相溶的有机溶剂中，达到一定浓 度时，会形成极性头在内，非极性头在外的聚集体，这种聚集体为反 胶团(当体系中含量一定量的水，则在反胶团中心有一个水池，可以 包围水溶性的蛋白质分子(这种反胶团的有机溶剂与蛋白质水溶液混 合时，一定条件下，蛋白质分子能够从水相进入到反胶团的中心水池， 经过分相后，再将有机相与另一水相接触，改变条件，即可打开胶团， 释放蛋白质分子，从而达到萃取分离的目的。
三、实验流程
• • • • 预处理 粗提取
盐析法
将蛋清搅拌至稠度均匀
取匀浆液,加0.102mol/L磷酸缓冲液 (pH610),超声15min后加入NaCl使其浓 度为110mol/L,离心除去杂蛋白
弱酸性阳离子交换树脂 XIDACE2WCX柱纯化 溶菌酶生物活性的测定按溶壁浊度法 蛋白质浓度的测定按Lowry法
鸡蛋清中溶菌酶的分离纯化
生制12 李雅 26
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一、实验材料——鸡蛋清
理化性质：溶菌酶广泛存在于自然界中，其中以蛋清含量最为 丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残 基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶 构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。 可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性 菌； 鸡蛋清中溶菌酶是一种罕见的稳定蛋白质，对温度和酸不敏感， 在弱碱性条件下稳定； 鸡蛋清中溶菌酶的等电点为10.8，远大于鸡蛋清中其他蛋白质 的等电点。
精细纯化
离子交换 树脂法
•
• 溶菌酶活力测定
参考文献：李蓉，陈国亮.高校阳离子交换色谱法分离纯化蛋清中的溶菌酶[J],色谱， 2002,20（3）:259-261
四、结果
• 盐析过的蛋清经XIDACE2WCX柱纯化后溶菌酶活性回收率为107%, 表明溶菌酶在柱上几乎无活力损失,比活为15467U/mg,较过柱前纯化 倍数提高516倍。 • 为了检查制备的溶菌酶纯度,进行尺寸排阻色谱分析,得到一狭窄单峰, 说明纯化后的溶菌酶具有较高纯度。整个试验从蛋清预处理到高纯度 溶菌酶的制备不超过2h,此法较经典软基质离子交换色谱分离速度快、 纯化效率高、酶的活性回收率高。
二、方法及原理
方法：离子交换色谱法 原理：离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合 力的差异进行物质分离的操作技术,由于具有简便、高效、成本低,通 常选择弱酸性阳离子交换树脂进行分离。
离子交换法(ion exchange process)是液相中的离子和固相中离子间 所进行的一种可逆性化学反应，当液相中的某些离子较为离子交换固 体所喜好时，便会被离子交换固体吸附，为维持水溶液的电中性，所 以离子交换固体必须释出等价离子回溶液中。