紫杉醇生物合成

酶催化紫杉醇生物合成研究进展

摘要：目前紫杉醇的全合成与半合成都远远难以满足市场的需要，酶催化紫杉醇生物合成有望成为解决该问题的可行途径。本文综述了酶催化紫杉醇生物合成研究进展。关键词：紫杉醇酶生物合成

1前言

紫杉醇(paclitaxel ,商品名Taxol) 是从红豆杉属植物树皮中提取分离出来的一种具有显著抗癌作用的紫杉烷二萜类化合物,现已成为临床上治疗肿瘤的重要药物。但其资源十分匮乏,单纯从含量极低的天然红豆杉植物中提取紫杉醇无法满足临床用药需求,紫杉醇的药源问题引起人们的极大关注。十多年来,科学家一直在研究解决紫杉醇药源的途径,如化学合成紫杉醇、培育高产量红豆杉栽培品种、筛选生产紫杉醇的微生物、利用红豆杉细胞工程生产紫杉醇等,并取得了一定的进展。但紫杉醇的化学全合成(或半合成) 步骤复杂、成本高,还无商业应用价值,利用内生真菌培养及红豆杉植物愈伤组织、细胞与原生质离体培养体生产紫杉醇不仅产量不高,而且稳定性也比较差,尚难以实现工业化生产。为此各国科学家在筛选高产量红豆杉栽培品种、化学合成、生物技术及微生物生产等方面做了大量的研究工作[1]。随着紫杉醇生物合成途径的逐步阐明及越来越多的关键酶和相关酶的基因的克隆和功能重组表达, 利用基因工程方法对红豆杉从基因水平上进行改造或对产紫杉醇的内生真菌菌种进行改造有可能成为解决紫杉醇资源短缺的有效途径。

2酶催化紫杉醇生物合成

紫杉醇的分子式为C47H51NO14, 其化学结构分为两个部分, 基本骨架部分是一个紫杉烷( taxane) 类的三环二萜, 侧链包括3个芳香环(1个苯环,2个苯甲酰环) 和1个环氧丙烷环(D 环) (图一)。目前已从红豆杉属植物中分离出350余种紫杉醇类似物, 不同的化合物通常在紫杉烷骨架的C1、C2 、C5 、C7 、C10 和C13 位上具有不同的取代基团[2]

图一紫杉醇结构

红豆杉植物中可能存在多条紫杉醇生物合成途径[2] 。紫杉醇及其相关的带有C13位侧链化合物的生物合成途径可分为紫杉烷碳环系统的生物合成、侧链的生

物合成、紫杉烷系统和侧链的酯化反应, 形成完整的紫杉醇分子三个主要阶段。紫杉烷碳环系统是由GGPP (geranylgeranyl pyrophosphate) 环化而来; 侧链是由苯丙氨酸经β-苯丙氨酸而形成。

图二紫杉醇生物合成示意图

紫杉二烯合成酶与其他植物的萜类环化酶在很多性质上是相似的,但要纯化到足够量的酶来制备抗体及进行cDNA 克隆是非常困难的。由于已经证实在紫杉醇生物合成途径中,由GGPP 环化成紫杉二烯是一个慢的或限速的反应步骤,因此增强环化反应就会提高紫杉烷的含量,所以环化酶就是一个用作基因分离的最好的目标。乙酰基在紫杉烷类化合物中相当常见,因此可以认为乙酰基转移酶也是一类起重要作用的酶[3]。。沈月毛等[4]使用提取自T. Media的无细胞粗酶,通过底物竞争反应,证明了10-去乙酰基baccatin Ⅲ在酶催化下专一性地转化为baccatin Ⅲ,而10-去乙酰基taxol 在同样条件下不能转化为taxol ,从而说明10-去乙酰基baccatin Ⅲ→baccatin Ⅲ→taxol 是taxol 生物合成途径的正常步骤,10 - 去乙酰基taxol 则可能是taxol 的去乙酰降解产物。由此推测,天然紫杉烷类化合物的普遍酰基化现象可能是由于专一性和非专一性的酰基转移酶共同作用造成的,这也是影响紫杉醇产量的主要因素。

紫杉二烯合成酶是分子质量为79 000 u 的单体蛋白,它是一种相当典型的萜类环化酶,其分子质量、亚基构造、动力学常数、对金属离子的要求等均类似其他植物来源双萜环化酶,但它的最适pH 值高达8. 5 ,类似微生物的萜类环化酶[5]紫杉二烯合成酶的另一特点是低组织水平活性、低酶量水平,它所催化的反应步骤是慢速的,对创伤刺激不敏感,但茉莉酸甲酯可显著提高其mRNA 和酶量水平[6]。

紫杉二烯合成酶催化紫杉醇生物合成途径中的第一个定向的、慢速的步骤,然而该步骤并非限速步骤。即使如此,该酶cDNA 克隆成功是继实现根癌农杆菌介导红豆杉属植物遗传转化之后,红豆杉基因工程领域中的又一突破,为采用基因工程方法提高紫杉醇产量提供了有力的支持[7]。

细胞色素P450单加氧酶是一类依赖细胞色素P450的氧化酶,它们以分子氧作

为底物,酶活性易受CO 抑制,最适pH 为中性,所催化的加氧反应需在NADPH 存在条件下进行。发生在紫杉烷环上的所有羟基化反应以及C13 侧链上C’2 位的羟基化反应均为细胞色素P450单加氧酶类催化[8]

紫杉二烯-5α-醇-O-乙酰转移酶为439 个氨基酸残基组成的单体蛋白,分子质量为50 000 u ,最适pH 值为9. 0 ,它对紫杉二烯醇和乙酰CoA 表现出高度的选择性和很强的亲和力,不能催化更高级的紫杉醇前体如10-去乙酰巴卡亭Ⅲ或巴卡亭Ⅲ乙酰化,其活性不依赖于金属离子的存在。该酶与其他植物来源酰基转移酶的氨基酸序列有较高的同源性,达50 %～56 % ,活性中心拥有见于其他酰基转移酶中的HXXXDG基序, 其中His 残基对它的催化活性至关重要[9]。

10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-O-乙酰转移酶是由440 个氨基酸残基组成的单体蛋白,分子质量为49 052 u ,最适pH 值为7. 5 ,对紫杉烷环上的10-羟基官能团具有高度的区域专一性,不能使1β-、5α-、7β-或13α-羟基乙酰化。10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-O-乙酰转移酶与紫杉二烯-5α-醇-O-乙酰转移酶的氨基酸序列同源性很高,达64 % ,与其它植物来源乙酰转移酶的同源性达56 %～57 %;该酶也拥有HXXXDG基序,这个序列单元为酰基转移酶类催化酰基转移至醇类底物所必需[10]。

苯丙氨酸氨基变位酶催化C13 侧链合成的第一步反应,这步反应是一个发生在苯丙氨酸分子内氨基从α位迁移到β位的反应,其酶促催化证据由Walker 等[11]从太平洋红豆杉幼茎细胞抽提物中获得,并对它的催化特性作了初步研究。该酶是在植物中首次发现的氨基变位酶,并且是目前在生物体内所发现的唯一的苯丙氨酸氨基变位酶,它的催化机理不同于微生物来源的氨基变位酶。目前对苯丙氨酸氨基娈位酶的其它酶学特性还知之甚少。鉴于红豆杉植物体内巴卡亭Ⅲ的丰度远大于紫杉醇,因而紫杉醇双萜母核单元的生物合成对终产物的形成不构成限速影响,途径中的限速步骤极可能存在于C13 侧链的生物合成过程中。因此,苯丙氨酸氨基变位酶是一个潜在的限速酶[7]。

GGPP 合成酶为异戊二烯转移酶家族成员,催化三异戊二烯单元———法尼基焦磷酸( FPP) 与单异戊二烯单元( IPP)缩合,形成双萜化合物的通用前体GGPP。该酶为二聚体蛋白,分子质量约60 000 u ,以Mg2 +为最佳辅因子,丙烯基化合物DMPP、香叶基焦磷酸( GPP)和FPP 均可作其底物,对它们的亲和力大小依次为GPP > FPP > DMPP ,GGPP 合成酶前体蛋白N 末端含有长度约为100 个氨基酸残基的质体转移肽,前体蛋白的合成受茉莉酸甲酯诱导,其cDNA 克隆已采用同源PCR 克隆法,从加拿大红豆杉cDNA 文库中分离出,并在酵母表达系统中实现了该基因的功能性表达[9]。

3结语：

紫杉醇生物合成全过程约20 步酶促反应,其中紫杉二烯合酶、紫杉二烯-5α- 羟化酶、紫杉烷-10β-羟化酶、紫杉烷-13α- 羟化酶、紫杉二烯-5α- 乙酰转移酶、紫杉烷-2α-苯甲酰转移酶、10 -去乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-乙酰转移酶、3- 氨基-3 -苯基丙酰转移酶和3- N -去苯甲酰-2- 脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶等主要的相关酶基因已成功克隆与表达,为进一步利用现代生物技术提高紫杉醇产量奠定了良好基础. 然而,紫杉醇生物合成的详细过程、反应机理还没完全阐明,近一半的相关酶基因还没有得到克隆与表达. 其中,参与形成紫杉醇环氧D 环的环氧化酶和C5 的乙酰基转移到C4 的变位酶还未确定;催化紫杉醇核心骨架及侧链C2 羟基化反应的细胞色素P450 羟化酶中有5 个酶还未成功表达;参与侧链生物合成的苯丙氨酸变位酶也未克隆与表达[12]。可见酶催化紫杉醇生物合成还没达到