高效液相色谱法基本原理
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液固吸附色谱法 固定相：吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5-10μm 流动相：有机溶剂 适用于分离分子量200-1000的组分，大多数用于 非离子型化合物的分离，常用于分离同分异构体。 各组分的出峰顺序 极性较小组分，吸附力较弱，容易解吸，先流出。 极性较大组分滞留作用大，后流出。 饱和烃 < 烯 < 芳烃 < 醚 < 醛酮 < 酸
下次课程问题
三种组分苯、萘、联苯，如何选择一个最佳的色谱分离条件， 既能达到良好的分离度，又能在短时间内完成分析任务？
反相色谱法的分离机理1 反相色谱法的分离机理1
疏溶剂理论： 当溶质分子进入极性流动相后,即占 据流动相中相应的空间，而排挤一部分 溶剂分子； 当溶质分子被流动相推动和固定相接 触时，溶质分子的非极性部分或非极性 分子）会将非极性固定相上附着的溶剂 膜排挤开，直接和非极性固定相上的烷 基官能团相结合（吸附）形成缔合物， 构成单分子吸附层； 当流动相极性减小时，这种疏溶剂斥 力下降，会发生解缔，并把溶质分子释 放而被洗脱下来
色谱类型选择
正确地选择色谱类型 尽可能多的了解样品性质 化学结构 极性和稳定程度 水中和有机溶剂中溶解度 相对分子质量的大小 熟悉各种色谱类型主要特点应用范围
色谱类型选择
液相色谱法实例
按固定相与流动相相对极性的不同，液液分配色谱可分 为哪两类方法？现在有A、B两物质，极性A＞B，问在两种 液液分配色谱上的出峰顺序如何？ 分离下述化合物，宜选用何种色谱方法？ （A）聚苯乙烯相对分子量分布 （B）多环芳烃 （C）氨基酸 （D）Ca2+，Ba2+，Mg2+
其他类型色谱法
其他类型色谱法 按分离机制分类： 液固吸附色谱法 离子色谱法 凝胶色谱法（分子排阻色谱法） （空间排阻色谱法）
液固吸附色谱实例
氯化噻吩嗪四种异构体的分离 异构体具有不同的空间排列方式，因此 吸附剂对它们的吸附能力有所不同，从 而得到了分离。
氯化噻吩嗪 四种异构体的分离色谱图
液固吸附色谱
分离机理实例
例：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。
固定相： 固定相：C1 固定相： 固定相：C8 固定相： 固定相：C18
时间， 时间，min
1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯 尿嘧啶； 苯酚 苯酚； 乙酰苯 乙酰苯； 硝基苯 硝基苯； 苯甲酸甲酯 苯甲酸甲酯； 甲苯 尿嘧啶
液液分配色谱
正相色谱法 1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物. 酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出 反相色谱法 1.非极性固定相 C18（简称ODS） 、C8 2.极性流动相 水或缓冲液 3.极性调节剂 甲醇、乙腈、四氢呋喃 4.分离非极性和极性较弱化合物 占整个HPLC应用的80%左右 5.组分流出顺序 极性大先洗出
键合相色谱—固定相
使用条件 为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值， 但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8）。 太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。 特点 使用过程中不流失 均一性和化学稳定性好 重现性好分离效率高 适于梯度洗脱 传质阻抗小
液液分配色谱
液液分配色谱法 固定相 将特定的液态物质涂于担体表面 化学键合于担体表面而形成的有机键合层 如C18（十八烷基硅烷）、 C8（辛烷基）、氨基键合硅胶 ） 固定相类型 极性固定相：正相色谱 以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-） 等键合在硅胶表面制成的 非极性固定相：反相色谱 反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料，在 分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键 合固定相。
离子交换色谱法
离子交换色谱法 固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架， 在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基 在表面未端芳环上接上季胺基 阳离子交换树脂 阴离子交换树脂
流动相：电解质溶液、有机弱酸或有机弱酸盐溶液
＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＳＯ４２－ ＋ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＣＯ ２－ ３ ＋ ＋ ＨＣＯ３－ Ｃｌ－ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＋ ＣＯ３２－
键合相色谱—流动相
反相色谱 常见流动相 流动相洗脱强度顺序：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷（与 水不混溶） 若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有 机酸、有机碱、酚类等 常见固定相 反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料，在分离极性 很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。
液相色谱分析法模块之
任务5 任务5 高效液相色谱法 分离原理
能力目标
理解已知分析方法中采用的色谱类型 能够正确解释色谱分离过程 能够根据组分性质选择合适的色谱类型
课程引入
归一化法测定分析纯甲苯试剂的纯度 色谱柱: 4.6mm×150mm 固定相: 十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相: 水:甲醇=15:85 外标法测定叶酸片中叶酸的含量 色谱柱: 4.6mm×250mm 固定相: 十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相: 磷酸二氢钠缓冲液:甲醇=80:20
课程引入
液相色谱是如何完成混合物的分离？ 混合物中各组分在固定相和流动 相之间会发生吸附、溶解或其他 亲和作用，这种作用存在差异， 从而使各组分在色谱柱中的迁移 速度不同得到分离
玻璃柱 色素 碳酸钙颗粒 石油醚
液液分配色谱
液液分配色谱法 实例：归一化法测定分析纯甲苯试剂的纯度 色谱柱: 4.6mm×150mm 固定相: 十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相: 水:甲醇=15:85
液固吸附色谱分离机理
液固吸附色谱法分离机理 吸附 脱附 再吸附 再脱附 … 分离过程是一个吸附 －脱附的平衡过程。
离子色谱法实例
离子交换色谱法 油田水质中的阴离子分析 固定相：薄壳型阴离子交换树脂 (3×250mm) 流动相：0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1 Na2CO3
源自文库ＣＯ３２－ ＣＯ３２－ ＨＣＯ３－
Ｃｌ－
＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＣＯ３２－ ＳＯ４ － ＋ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＣＯ３２－ ＋ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＋ ＣＯ３２－
ＣＯ３２－
ＳＯ４２－ ＨＣＯ３－
ＨＣＯ３－
离子交换色谱法分离机理
离子交换色谱法 分离原理 树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的 离子进行可逆交换而分离。 应用 离子交换色谱法主要用于分析阴，阳离子，凡是在溶剂中能够电离 的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。 分析物质 有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
反相键合相色谱法的分离机理2 反相键合相色谱法的分离机理2
影响溶质保留的三个主要因素： 溶质分子中非极性部分的总表面积 溶质和固定相接触的总表面积愈大，保留值愈大，所以溶质的极性愈弱， 疏水性越强，保留值越大。 键合相上的烷基总面积 烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长， 烷基的疏水特性增强，溶质的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大。 流动相的表面张力 流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强；溶质和烷基键合 相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱，导致溶质的保留值大。
凝胶色谱法实例
凝胶色谱（分子排阻色谱法） 油田用驱油剂聚丙烯酰胺损失量的测定？ 色谱柱：150mm×46mm 固定相：二醇基键合相，孔径200A，粒径5um 流动相:甲醇/0.05mol/LNaH2PO4 1-聚丙烯酰胺 2-原油+石油磺酸盐+氯化钠
凝胶色谱分离机理
凝胶色谱：（分子排阻色谱法） 分离机理 • 以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于 分子筛，但凝胶的孔径比分子筛要 大得多。 • 小分子量的化合物可以进入孔中， 滞留时间长；大分子量的化合物不 能进入孔中，直接随流动相流出。 • 常用于分离高分子化合物，如组织 凝胶色谱分离示意图 提取物、多肽、蛋白质、核酸等。
下次课程问题
三种组分苯、萘、联苯，如何选择一个最佳的色谱分离条件， 既能达到良好的分离度，又能在短时间内完成分析任务？
反相色谱法的分离机理1 反相色谱法的分离机理1
疏溶剂理论： 当溶质分子进入极性流动相后,即占 据流动相中相应的空间，而排挤一部分 溶剂分子； 当溶质分子被流动相推动和固定相接 触时，溶质分子的非极性部分或非极性 分子）会将非极性固定相上附着的溶剂 膜排挤开，直接和非极性固定相上的烷 基官能团相结合（吸附）形成缔合物， 构成单分子吸附层； 当流动相极性减小时，这种疏溶剂斥 力下降，会发生解缔，并把溶质分子释 放而被洗脱下来
色谱类型选择
正确地选择色谱类型 尽可能多的了解样品性质 化学结构 极性和稳定程度 水中和有机溶剂中溶解度 相对分子质量的大小 熟悉各种色谱类型主要特点应用范围
色谱类型选择
液相色谱法实例
按固定相与流动相相对极性的不同，液液分配色谱可分 为哪两类方法？现在有A、B两物质，极性A＞B，问在两种 液液分配色谱上的出峰顺序如何？ 分离下述化合物，宜选用何种色谱方法？ （A）聚苯乙烯相对分子量分布 （B）多环芳烃 （C）氨基酸 （D）Ca2+，Ba2+，Mg2+
其他类型色谱法
其他类型色谱法 按分离机制分类： 液固吸附色谱法 离子色谱法 凝胶色谱法（分子排阻色谱法） （空间排阻色谱法）
液固吸附色谱实例
氯化噻吩嗪四种异构体的分离 异构体具有不同的空间排列方式，因此 吸附剂对它们的吸附能力有所不同，从 而得到了分离。
氯化噻吩嗪 四种异构体的分离色谱图
液固吸附色谱
分离机理实例
例：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。
固定相： 固定相：C1 固定相： 固定相：C8 固定相： 固定相：C18
时间， 时间，min
1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯 尿嘧啶； 苯酚 苯酚； 乙酰苯 乙酰苯； 硝基苯 硝基苯； 苯甲酸甲酯 苯甲酸甲酯； 甲苯 尿嘧啶
液液分配色谱
正相色谱法 1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物. 酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出 反相色谱法 1.非极性固定相 C18（简称ODS） 、C8 2.极性流动相 水或缓冲液 3.极性调节剂 甲醇、乙腈、四氢呋喃 4.分离非极性和极性较弱化合物 占整个HPLC应用的80%左右 5.组分流出顺序 极性大先洗出
键合相色谱—固定相
使用条件 为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值， 但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8）。 太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。 特点 使用过程中不流失 均一性和化学稳定性好 重现性好分离效率高 适于梯度洗脱 传质阻抗小
液液分配色谱
液液分配色谱法 固定相 将特定的液态物质涂于担体表面 化学键合于担体表面而形成的有机键合层 如C18（十八烷基硅烷）、 C8（辛烷基）、氨基键合硅胶 ） 固定相类型 极性固定相：正相色谱 以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-） 等键合在硅胶表面制成的 非极性固定相：反相色谱 反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料，在 分离极性很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键 合固定相。
离子交换色谱法
离子交换色谱法 固定相:离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架， 在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基 在表面未端芳环上接上季胺基 阳离子交换树脂 阴离子交换树脂
流动相：电解质溶液、有机弱酸或有机弱酸盐溶液
＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＳＯ４２－ ＋ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＣＯ ２－ ３ ＋ ＋ ＨＣＯ３－ Ｃｌ－ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＋ ＣＯ３２－
键合相色谱—流动相
反相色谱 常见流动相 流动相洗脱强度顺序：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷（与 水不混溶） 若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流动相，可用于分离极性化合物 若采用水和无机盐的缓冲液为流动相，则可分离一些易离解的样品，如有 机酸、有机碱、酚类等 常见固定相 反相色谱法最常用的固定相是C18、C8和苯基键合相的填料，在分离极性 很大的化合物时，也可以采用氨基、氰基等极性基团键合固定相。
液相色谱分析法模块之
任务5 任务5 高效液相色谱法 分离原理
能力目标
理解已知分析方法中采用的色谱类型 能够正确解释色谱分离过程 能够根据组分性质选择合适的色谱类型
课程引入
归一化法测定分析纯甲苯试剂的纯度 色谱柱: 4.6mm×150mm 固定相: 十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相: 水:甲醇=15:85 外标法测定叶酸片中叶酸的含量 色谱柱: 4.6mm×250mm 固定相: 十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相: 磷酸二氢钠缓冲液:甲醇=80:20
课程引入
液相色谱是如何完成混合物的分离？ 混合物中各组分在固定相和流动 相之间会发生吸附、溶解或其他 亲和作用，这种作用存在差异， 从而使各组分在色谱柱中的迁移 速度不同得到分离
玻璃柱 色素 碳酸钙颗粒 石油醚
液液分配色谱
液液分配色谱法 实例：归一化法测定分析纯甲苯试剂的纯度 色谱柱: 4.6mm×150mm 固定相: 十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相: 水:甲醇=15:85
液固吸附色谱分离机理
液固吸附色谱法分离机理 吸附 脱附 再吸附 再脱附 … 分离过程是一个吸附 －脱附的平衡过程。
离子色谱法实例
离子交换色谱法 油田水质中的阴离子分析 固定相：薄壳型阴离子交换树脂 (3×250mm) 流动相：0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1 Na2CO3
源自文库ＣＯ３２－ ＣＯ３２－ ＨＣＯ３－
Ｃｌ－
＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＣＯ３２－ ＳＯ４ － ＋ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＣＯ３２－ ＋ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＨＣＯ３－ ＋ ＋ ＣＯ３２－
ＣＯ３２－
ＳＯ４２－ ＨＣＯ３－
ＨＣＯ３－
离子交换色谱法分离机理
离子交换色谱法 分离原理 树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的 离子进行可逆交换而分离。 应用 离子交换色谱法主要用于分析阴，阳离子，凡是在溶剂中能够电离 的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。 分析物质 有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
反相键合相色谱法的分离机理2 反相键合相色谱法的分离机理2
影响溶质保留的三个主要因素： 溶质分子中非极性部分的总表面积 溶质和固定相接触的总表面积愈大，保留值愈大，所以溶质的极性愈弱， 疏水性越强，保留值越大。 键合相上的烷基总面积 烷基键合固定相的作用在于提供非极性的作用表面。随着碳链的加长， 烷基的疏水特性增强，溶质的保留值也随烷基碳链长度的增加而增大。 流动相的表面张力 流动相的表面张力愈大，介电常数愈大，极性亦愈强；溶质和烷基键合 相的缔合作用愈强，流动相的洗脱强度弱，导致溶质的保留值大。
凝胶色谱法实例
凝胶色谱（分子排阻色谱法） 油田用驱油剂聚丙烯酰胺损失量的测定？ 色谱柱：150mm×46mm 固定相：二醇基键合相，孔径200A，粒径5um 流动相:甲醇/0.05mol/LNaH2PO4 1-聚丙烯酰胺 2-原油+石油磺酸盐+氯化钠
凝胶色谱分离机理
凝胶色谱：（分子排阻色谱法） 分离机理 • 以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于 分子筛，但凝胶的孔径比分子筛要 大得多。 • 小分子量的化合物可以进入孔中， 滞留时间长；大分子量的化合物不 能进入孔中，直接随流动相流出。 • 常用于分离高分子化合物，如组织 凝胶色谱分离示意图 提取物、多肽、蛋白质、核酸等。