透明质酸的发酵生产工艺

透明质酸的发酵生产工艺
专业：生物制药姓名：邓海艳课程名称：发酵工程
摘要：透明质酸广泛分布于各种动物组织中，由于动物组织原料有限，且透明
质酸的含量低，同时提取成本高，因而价格十分昂贵。

而微生物发酵法，所需的原料
易得，大大降低了生产成本。

同时由于透明质酸存在于菌体英膜上，易于与菌体分离，
因而减少了提取成本。

本篇文章就是以一株兽疫链球菌作为生产菌株进行研究重点讨
论了温度、pH值、搅拌转速，发酵时间以及培养方式等发酵条件对透明质酸产量和分
子质量的影响。

关键词：透明质酸；产量；影响因素；发酵条件
透明质酸（hyaluronic acid，简称HA）又名玻璃酸，是一种高分子量的酸性黏多
糖，广泛存在于脊椎动物的各种组织细胞间质中。

HA分子中的羧基和极性基团可与水
形成氢键而结合大量的水，可以吸收与保持自身体重千倍以上的水分，是国际上公认
的最好的保湿剂，还具有润滑，促进关节愈合等作用[1]。

不同分子质量的HA有不同的
用途，低分子质量的HA通常用作食品原料，中等分子质量的HA主要应用于化妆品，
而高分子量的HA在医学上有较高的应用价值。

1.透明质酸的微生物发酵法
从上个世纪30年代开始，人们便开始进行微生物发酵法生产HA的研究。

微生物
发酵法生产HA较动物组织提取法有许多的优点，比如生产成本低廉，规模不受原料
限制，因为发酵液HA以游离状态存在所以易于HA的分离纯化。

能够产生HA的链
球菌有A群和C群两类，其中A群主要有化脓链球菌, 一般不用作生产菌种，因为其
致病性较高；C群有兽疫链球菌、马疫链球菌、类马链球菌等均属于非人体致病菌，
所以可以用作HA的生产菌种罗瑞明等从患肺炎的羊肺液中分离出兽疫链球菌菌株，
通过培养基优化得到的HA产量为1.88 g/L。

冯建成等以Streptococcus equiSHO为出发
菌株，通过物理和化学诱变选育到1株遗传稳定、无溶血性且透明质酸酶缺陷型菌株
SH0201，通过摇瓶发酵试验得到相对分子量2.06xl06 Da的HA。

李自刚等从奶牛鼻黏
膜内分离到1株兽疫链球菌，经过紫外线诱变和亚硝基胍诱变处理后HA产量能达到
6.94 g/L[2]。

通过微生物发酵法生产HA的品质和产量主要受到以下几个方面的影响:
首先是菌种选择；其次是培养基的优化和发酵条件的优化；最后是生物工艺的下游技术即HA的提取工艺。

国内外诸多学者研究了微生物发酵法生产HA的工艺。

国内，凌沛学等首先开始对HA的发酵生产的工艺进行研究，分别进行了实验室小试和生产车间中试的研究；陈永浩等利用γ射线和紫外线结合方法和通过辐照进行诱变育种，得到了没有溶血性的菌株，使得HA产量及相对分子质量得到了进一步的提高；杨利等对透明质酸分子量的影响因素进行了探索，得到溶氧水平和搅拌转速与HA分子量的关系；付莉等从自然界蹄选到一株透明质酸的产生菌；叶华等对于透明质酸发酵流加过程进行了研究；史鹏等，对发酵法生产透明质酸提取工艺方法进行了研究；郝宁等对HA的生产菌进行了基因改造，基因重组菌的HA产量得到很大程度的提高。

HA 的发酵生产主要工艺流程如下:
斜面种子一摇瓶种子一接种一发酵培养一补料一放罐一发酵液（加乙醇粗提）一粗提液（加助滤剂、活性炭，调pH）—过滤（去除杂质）一滤液（乙醇沉淀）一沉淀物（脱水干燥）一成品透明质酸
2.发酵培养基成分和发酵条件对HA的影响
2.1不同碳源对发酵的影响
当碳源为2.0%，酵母膏1.0%，蛋白胨1.0%，KH2PO4 0.2%，NaCl 0.2%，MgSO4·7H2O 0.03%，pH7.2，装量为10%；37℃，100 rpm培养18 h。

以葡萄糖为碳源时，透明质酸的产量最高，其后依次是蔗糖、麦芽糖和果糖。

而木糖和半乳糖利用情况不好，以它们为碳源时透明质酸产量只有0.4 g/L和0.42 g/L。

其原因可能是UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄合成透明质酸的前体物质，也是合成菌体的前体物质，菌体可以容易地分解蔗糖和麦芽糖得到葡萄糖，果糖也很容易转化为葡萄糖，所以它们能被比较好的利用，而其他两种碳源的利用情况则相对差些。

因此本实验采用葡萄糖为碳源。

2.2不同氮源对发酵的影响
当氮源为2.0%，葡萄糖2.0%，KH2PO40.2%，NaCl 0.2%，MgSO4·7H2O 0.03%，pH7.2，装量为10%，37℃，100 rpm培养18 h。

氮源不仅为菌体生长提供氮元素，而且大多数有机氮源还能提供多种必需的生长因子。

当发酵培养基的氮源采用酵母膏时，透明质酸的产量最高。

其次是酵母膏和蛋
白胨的混合氮源，其余的均较底。

而采用无机氮源（NH4）2SO4时，透明质酸含量和菌体量都是最低的。

兽疫链球菌的营养要求比较高，TCA循环不完全，有多种氨基酸不能自身合成，而且不能完全由自身合成核昔酸。

而酵母膏中含有大量的菌体生长所需的生长因子，这可能是兽疫链球菌H-35以酵母膏为氮源时生长和发酵较好的原因之一。

2.3酵母膏用量对发酵的影响
当氮源为酵母膏，葡萄糖2.0%，KH2PO40.2%，NaCl 0.2%，MgSO4·7H2O 0.03%，pH7.2，装量为10%，37℃，100 rpm培养18 h。

低酵母膏用量时，细胞产出的透明质酸含量较低，细胞量也较低，逐步提高酵母膏的含量，透明质酸含量和细胞量均有大幅提高。

当加入量为2%时，透明质酸含量达到最大值。

所以本研究中选用酵母膏为氮源，用量为2.0%。

2.4不同温度对发酵产物的影响
发酵过程中，温度是一个关键的因素，对菌体生长、代谢速度有很大的影响。

当温度为35℃时，HA产量最高，达到1.07g/L；当温度高于35℃，透明质酸的产量却随温度的升高而呈下降的趋势。

但在实验温度范围内菌体生长却随温度的升高菌体量增多，表明高温有利于菌体的生长，碳源更多的转化为菌体。

所以本实验发酵温度为35℃。

2.5搅拌转速对HA产量和分子质量的影响
搅拌转速是影响发酵液溶解氧浓度的关键因素之一。

HA是HA产生菌荚膜的主要组成成分，搅拌可以强化气-液间氧的传递，既维持发酵液中有足够的溶氧，为细胞的生长提供氧气，又可使发酵液中的各营养基质混合均匀，有利于细胞的吸收和利用，同时可以加速荚膜从细胞表面脱离。

高海军报道，只有在高搅拌转速时发酵体系才处于全部混合状态，在较高的搅拌速率650 r/min下发酵时可以得到较高的HA产量，为411 g/L，产率系数为0.08[3]。

这是因为HA溶液是假塑性物体，具有剪切变稀的特性，高速搅拌时，发酵液传质，传氧性能得到改善，有利于菌体生产和产物合成，同时，较高速的搅拌能使荚膜更快地脱落，解除其对细胞吸收营养物质的阻碍。

Hasegawa，却认为，HA的产量在一定搅拌速度内会随着搅拌速率的增加而增加，并且随着换气速率的加快，HA的产量也会增加，然而过高的搅拌速率会破坏细胞而导致HA产量下降，这是因为过高速的搅拌会产生很大的剪切作用，对所培养的菌体细胞造成伤害，使得
受损细胞合成HA的能力大大下降了。

而成霞则认为在发酵前期采用较低的搅拌转速（200 r/min），使菌体细胞能快速生长，发酵开始10 h后适当提高搅拌转速（350 r/min），一方面可通过降低菌体的生长速率来降低乳酸的积累量；另一方面由于此时发酵液很黏稠，提高搅拌转速可以促进混合，有利于HA发酵的进行。

David将搅拌速度从300~1000 r/min进行变化，HA的分子质量基本没有改变[4]。

2.6不同装量对发酵产物的影响
随着装量增大，菌体生长较好，但透明质酸的产量在8%的装量时出现高峰。

说明了装量越大，溶氧越低，不利于透明质酸的合成。

因此发酵中发酵液的装量采用8%。

2.7发酵条件的优化
根据文献选择对兽疫链球菌生长及产透明质酸影响较大的四个因素（初始葡萄糖浓度、MgSO4·7H2O的浓度、初始pH和摇床转数）来设计正交试验表。

其它相同的条件为：酵母膏2.0%, KH2PO4 0.2%，NaCl 0.2%，装量为8%，培养18 h。

通过极差分析，影响因素大小依次是：pH>摇床转速> MgSO4；含量>初始葡萄糖。

最优组合是pH7.0，摇床转速200 rPm，MgSO4含量0.06%，初始葡萄糖浓度4.0%。

在初始葡萄糖浓度4.0%，酵母膏2.0%，NaCl0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.06%，初始pH7.0，装量为8%，35℃，200 rpm培养18 h。

实验的结果是透明质酸产量为1.43 g/L，比优化前提高了28.8%。

pH是一项重要的发酵参数，它对菌体的生长和产物的积累有很大的影响，发酵液的pH可以影响微生物细胞原生质的电荷，引起各种酶活力的改变，影响菌体对基质的利用速度和细胞的结果，以致影响菌体的生长和产物的合成[5]。

从实验数据可知，pH7.0时对发酵有利，过低和过高都不利于发酵产物的积累。

摇床转速表明，转数越高，越有利于透明质酸的合成和分泌。

原因是高转数，发酵液传质、传氧性能得到改善，有利于菌体的生长和产物合成。

由于荚膜会阻止营养物进入细胞，从而影响细胞的生长代谢和透明质酸的合成以及分泌。

较高的转数能使荚膜更快的脱落，解除荚膜对细胞吸收营养物质的阻碍。

透明质酸合成酶是透明质酸合成途径中的关键酶,该酶位于原生质体膜上。

它催化透明质酸的前体UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖转化成H，此酶的活性受Mg2+离子浓度的影响很大[6]。

当MgSO4·7H2O为0.06%时透明质酸合成酶活性最高。

因
此兽疫链球菌H-35最佳发酵条件是初始葡萄糖浓度4.0%，酵母膏2.0%，NaCl0.2%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.06%,初始pH7.0，35℃,装量为8%,200 rpm培养18 h。

3.透明质酸的纯化
参照应国清分离纯化玻璃酸的研究，采用阴离子交换树脂DEAE-纤维素对透明质酸粗品进行洗脱。

以去离子水为淋洗液，0.6 mol/LNaCl溶液作为洗脱液，分别测定流出液中透明质酸的O.D530值和蛋白质的O.D280值。

从中可看出，0.6 mol/LNaCl溶液作为洗脱剂时，透明质酸出峰时间早，峰形陡峭，峰值较高，拖尾较小，并且含蛋白质的量很低。

通过考马斯亮蓝染料结合法测得粗品和纯品的蛋白质含量分别为 2.84%和0.38%，说明经过DEAE-纤维素纯化以后，透明质酸得到很好的分离。

结论
虽然目前国内对微生物发酵法生产HA的研究逐渐增多，但是大部分还只是在实验室进行研究，对于将其投入工业化生产的技术还不够成熟。

尽管相对于动物提取法，产量有了很大提高，但是由于HA的需求增长非常快，产量仍是一个需要突破的瓶颈。

因此，发酵工艺条件作为影响HA产量的一个重要因素，特别是从工业化的角度上考虑时，仍需进一步的研究和探索。

今后，应在以下几方面展开进一步的研究：一是选育透明质酸酶缺陷型菌株，并根据HA的合成和代谢途径，进行发酵条件的优化，并通过建立动力学模型对生产进行评估；二是目前对发酵法生产HA的研究多集中于分批发酵，而分批发酵的转化率低，有底物抑制，葡萄糖效应，代谢阻碍等问题，不适合投入工业化的生产，应在补料分批发酵或连续发酵方面进行深入的研究。

参考文献
[1]郭学平，透明质酸在保健品中的应用[J]，中国生化药物杂志，2002，23（1）：49-51
[2]周荣清，透明质酸发酵液的絮凝预处理研究[J]，食品与发酵业，2001，27（12）：
16-18
[3]李建武，生物化学实验原理和方法[M]，北京大学出版社，2001，4：174
[4]杭生，透明质酸的离子交换层析纯化[J]，中国医药工业杂志，2001，32（11）：485-488
[5]高海军，营养条件对兽疫链球菌发酵生产透明质酸的影响[J]，生物工程学报，2000，16（3）：396-399
[6]鲁念慈，透明质酸的制备及其应用[J]，功能高分子学报，2001，14（3）：370-376
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