Second Harmonic Gener-ation：SHG二次谐波 应用研究

生物组织的激光成像

在新的世纪里，社会与科技的不断地进步不但促进生产力的高速发展，而且促使社会物质文明和精神文明达到了空前的高度。人类在享受飞速发展带来的繁荣的同时，过快的发展也给人类自身带来了很多生理和心理的健康问题。因此，人类越来越重视与健康有关的基本生物医学问题的研究，包括个体健康状况的检测，疾病的早期诊断以及治疗等方法与手段的研究，这也是世界各国研究机构的热点研究问题。

在此类研究中，最基本的是生物组织成像的问题。图像化的生物组织有利于医生对就诊者的情况有更加清晰，准确的掌握。随着激光技术于1960年被人类开发出来以后，其具备的单色性，高强度性等多项优点使得广大科研工作者致力于应用该技术于生物组织成像中，产生了区别于传统医学成像的现代生物激光成像学科。

近代显微成像技术的发展

近代生物成像技术，最早可以追溯到伦琴1895年发现X射线。后来出现了超声生物显微镜 (Ultrasound Bio-microscope，UBM)。在70年代中期，计算机层析成像术(X-ray Computed Tomography)[1-4]被引入生物成像技术。该方法是利用阵列探测器

测定物体各方向X射线透射量后，通过特定算法处理所取得的数据得到数字化重建断层图像。如今先进的核磁共振(MRI)波谱成像技术已经成为描绘蛋白质分子结构的原子三维空间分布图的重要手段[5-10]。目前通行的诊断方法用的X射线剂量虽然比以前少，但其还是有不可忽略的生物毒性。并且上述方法不但无法实现完全的非侵入性(Non-invasive)探测，分辨率也达到了理论极限，因此还不能完全满足科学研究与临床诊断对实时、高分辨率成像的要求。

在结合激光技术后，隧道扫描显微镜可以探测到物体表面的原子排列信息；激光共聚焦扫描显微镜(Laser Confocal Scanning Microscope)[11,12]可对活体细胞进行成像研究，分辨率可达纳米量级甚至更高；光学相干层析成像(Optical Coherence Tomography，OCT)[13-17]对生物组织断层扫描也可获得微米量级的分辨率成像。还有于20世纪90年代出现的双光子激光扫描共聚焦显微镜(Two-photon Laser Scanning Confocal Microscope，TPLSM)[18-20]，其激发光源采用近红外的飞秒脉冲激光，对生物样品的光损伤较小，并且穿透深度加大。而由于其激发效率与激光光强的平方成正比，非线性的阐值限制使得双光子荧光只发生在焦点附近的微小区域，因此降低了对焦点以外样品染料的漂白，减少光化学毒性。

二次谐波技术以及国内外发展研究状况

继共聚焦成像技术后，利用物质本身非线性效应，在高强度

激光激发下形成的双光子显微成像技术克服了普通共焦成像中空间滤波小孔易堵、调节困难等问题，并且在生物医学领域中，长的激发波长还可以明显地减少对实验样本的漂白损伤以及增加成像的层析深度。而作为一种特殊的双光子成像技术，二次谐波成像技术除了有上述优点以外，还具有更多的优点。包括了由于其利用超快激光脉冲与聚焦焦点中的生物组织相互作用产生倍频的相干辐射光作为成像信号，其激发效率与入射激发光的光强平方成正比，这种特定的局域性减少了其它普通成像机制的非焦点处光源产生的干扰，提高了成像的三维空间分辨率、信噪比以及对比度；其是一种生物组织的自发信号，无需外加分子探针即能检测到相对较强的信号，消除了染色对样本的染料致毒等负面影响；其使用的激发光为近红外波段，对于生物组织的穿透度深；其成像过程中无能量得吸收，消除了对样本的光损伤和光致毒，因此可以用于检测生物组织的长期动态特征；二次谐波显微镜可以收集背向信号，因此很易于与其它显微系统（OCT）联合使用，实现不同信号的互补与比较；二次谐波成像显微镜还可以在其它光学成像系统的基础上经过简易地改造获得。由于以上的种种优势，二次谐波技术在生物医学领域被广泛应用，涉及的范围包括许多生物组织[21-23]。最早在Goppert-Mayer的博士论文“原子中双光子量子跃迁的理论研究”中提到多光子激发[24]。1961年，Frnakne就在石英晶体中观测到波长为694.3nm的红宝石激光的倍频光[25]，Kleinman在1962年首次确证了在石英晶体中观

察到了非光学二次谐波现象(SHG)之后该技术便被用于获得更短波长的激光[25]。1963年，Kaiser和Garret首次报道了荧光素的双光子激发(TPE)，并指出有机荧光染料也可以通过双光子激发，其后出现了关于TPE光谱的大量报道[26]。 1968年，Blomebergen 在物质的界面观察到二次谐波现象，开创了表面二次谐波的研究[27]。1971年，Fine和Hansen在近透明组织中首次观察到了生物组织的二次谐波现象[28]。1978年，Geannaway和Sheppard提出了二次谐波成像方法[29]。 1986年, Feund等利用SHG研究老鼠尾巴肌腱胶原纤维首次进行了生物组织的SHG成像实验[30]。1990年，Denk博士将非线性效应成像技术用于生物领域，提出了双光子生物学显微镜。2001至2005年，Stoller和Sheepard等人利用胶原纤维二次谐波信号对激发光的偏振依赖性研究了生物组织中胶原纤维的种类分布、确定胶原纤维的方向和测量胶原的二阶非线性极化率[31-35]。2005年，Rebecca等人通过研究提出胶原纤维的二次谐波信号来源于胶原微纤维的管状结构[36]。

目前国内外学者对非线性光学二次谐波成像的研究已有大量的实验报道，关于SHG产生的物理机制也给予了一定的理论解释:Guo等对脂肪等生物组织产生的二次谐波进行了实验的对比研究[37,38]，指出脂肪的二次谐波比皮肤和肌肉的弱是因为脂肪组织中含非对称结构的分子少，SHG的产生来自生物组织的散射单元界面，对于各向同性介质由于其界面的反演对称破坏，因此在其界面就会产生SHG。Campaganola等人通过对活细胞进行的关

于SHG的实验研究从理论上强调了介质必须具有中心反演非对称性才能产生SHG[39-41]，并指出由于共振效应会得到SHG不同数量级的增强，共振效应的增强数量级能到达10105。Stoller等人发现胶原纤维谐波信号对激发光偏振角度的依赖性，并利用麦克斯韦方程推导得到SHG强度的表达式，对其机制进行了初步的理论分析，其中包含了相位匹配项因子[42]。国内有学者提出存在某种SHG背向散射增强机制，例如布拉格散射，在光栅常数适情况下，可以将前向的SHG较多地反射回来[23，43]；还有提出背向SHG 不是经过散射或反射产生，而是直接产生的，当激光聚焦到生物组织内部时，其背向SHG不止来自组织表面，也可以来自组织内部的微小界面，例如胶原原纤维的表面，则背向SHG有可能是所有胶原原纤维产生的表面SHG的总和[36]；此外，还指出有可能是倍频信号的贡献，例如超瑞利散射等。Ronald 等人在考虑到相位匹配的关系，根据扩展相位匹配（Relaxed phase matching）条件，给出了背向SHG的初步解释[44]。