磁性HRP的酶学研究

第21卷　第4期福建师范大学学报(自然科学版)Vol121　No14 2005年12月Journal of Fujian Normal University(Natural Science Edition)Dec12005文章编号:100025277(2005)0420063204

磁性HRP的酶学研究

马秀玲,黄丽梅,陈　盛

(福建师范大学化学与材料学院,福建福州　350007)

摘要:以磁性壳聚糖微球作载体对HRP进行固定化研究,同时为了便于比较,还用壳聚糖微球固定HRP.结果表明:磁性壳聚糖微球固定的HRP的理化性质优于壳聚糖微球固定的HRP,磁性酶因具有磁响应性,可方便、快速地从反应体系中分离.

关键词:磁性壳聚糖;HRP;固定化

中图分类号:Q55 文献标识码:A

Enzymic Properties of Magnetic H orseradish Peroxidase

MA Xiu2ling,HUANG Li2mei,CHEN Sheng

(College of Chemist ry and M aterials Science,Fujian Norm al U niversity,Fuz hou　350007,China)

Abstract:As a carrier,the immobilization of HRP on Magnetic Chitosan Microspheres was studied. In constrast to magnetic immobilized enzyme,the immobilization of HRP on Chitosan Microspheres was al2 so studied.The results showed that Magnetic Chitosan Microspheres immobilizing HRP had the better physicochemical properties than native HRP and Chitosan Microspheres immobilizing HRP,and because of its magnetic responsibility,it was simple and convenient to retrieve magnetic HRP.

K ey w ords:Magnetic Chitosan;HRP;immobilization

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)作为一种重要的分析试剂[1],广泛用于临床医学、环境化学和食品工业等领域.把HRP固定在水不溶性载体上,既可以反复回收利用HRP,也可以实现生产工艺和检验操作的连续化和工业化.

近年来,有文献报道用磁性高分子微球固定化脲酶、淀粉酶及中性蛋白酶等的研究[2-4],有关磁性高分子微球固定HRP的研究,未见报道.

壳聚糖是一种良好的蛋白质和酶的载体,近年来受到国内外不少学者的重视[5-6].本文将磁性壳聚糖微球(简称:MCS-M)用于固定化HRP,探讨了不同条件对固定化HRP的影响以及MCS-M固定化HRP的一些理化性质.

1　实验内容

111　仪器及试剂

11111　试剂

MCS-M(自制)[7],壳聚糖微球(简称CS-M,自制)[7],HRP(上海丽珠东风生物技术有限公司产品),磷酸盐缓冲液,焦性没食子酸(A1R),30%过氧化氢(A1R),乙醚(A1R),硫酸(A1R)等.

11112　仪器

电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂),721型分光光度计(上海第三分析仪器厂),p HS-2型酸度计(上海雷磁仪器厂),79-1型磁力搅拌器(常州国华电器有限公司)等.

　收稿日期:2005-03-15

　基金项目:福建省教育厅基金资助项目(JB01095)

　作者简介:马秀玲(1973—　),女,福建永定人,讲师,硕士.

112　HRP 的固定化

称取一定量(50mg )载体(戊二醛浓度为1815%合成的MCS -M 或CS -M ),用磷酸盐缓冲液(p H615)溶胀后,抽滤,加入215mL HRP 溶液(质量浓度:1mg/mL )和715mL 磷酸盐缓冲液.室温下搅拌115h ,于4℃静置8h 后,倒出上清液(对于MCS -M ,用磁铁将微球沉淀;对于CS -M ,用离心的方法将微球沉淀).用缓冲液洗涤固定化酶数次,直至上清液无蛋白(用福林-酚试剂法[8]检验)为止.所得的固定化酶(MCS -M 固定化酶或CS -M 固定化酶)在4℃的冰箱中保存.113　酶活力的测定[9]

用移液管取210mL 磷酸盐缓冲液(p H710)、110mL 0106%的过氧化氢溶液、210mL 510%的焦性没食子酸和1410mL 的蒸馏水,加入烧杯中,调温至30℃.滴入110mL 的酶溶液(或加入50mg 的固定化酶),混合,在30℃下反应1min 后加入110mL 硫酸溶液(110mol/L ),终止反应.将反应混合液用乙醚萃取数次,直至萃取液为无色,然后将萃取物定容至100mL ,在420nm 处测量吸光值(E 420).

酶活力单位定义:在上述条件(30℃、p H710及1min )下,每100mL 乙醚提取1mg 红紫　精时所需的酶量为1个单位.

2　结果与讨论

211　pH 值对酶活力的影响

酶的主体是蛋白质,其催化能力对外部环境特别是对p H 非常敏感.平行取固定化酶50mg 和原酶液110mL (质量浓度:0102mg/mL ,以下均与此相同)各7份,分别在不同p H 条件下测酶活力,结果见图 1.

图1　p H 对酶活力的影响由图1可见,在本实验条件下,原酶及CS -M 固定

化HRP 的最适p H 均为615,而MCS -M 固定化HRP 的

最适p H 往碱方向偏移,且有两个较适宜p H 值,分别为

710和910.据文献[10]报道:当酶被结合到聚合阳离

子载体上时,固定化酶的最适p H 往酸性一侧偏移,而本

实验结果与此不同,这可能是因为:MCS -M 固定化

HRP 时,酶分子的表面电性,特别是酶活性中心的残基

图2　酶的酸碱稳定性比较

电性变化所致.

212　酶的酸碱稳定性测定

酶象其它蛋白质一样,只有在有限的p H 范围里才是

稳定的,通过酶的酸碱稳定性的测定可以了解该酶所稳定的p H 范围.

平行取固定化酶50mg 和原酶液110mL 各5份,分别加入不同p H 的缓冲液210mL ,室温放置2h 后,测定酶的活力,并以p H710时的酶活力为100%,

计算残余活力.结果如图2所示.

结果表明:在不同p H 介质中置放2h 后,各酶所表现

的活力稳定范围不同.原酶在p H610～810范围内放置2h

后,活力相对稳定;MCS -M 固定化HRP 在p H510～915范

围的环境中放置2h 后,活力仍较高;CS -M 固定化HRP

的活力稳定范围为610～910.这一结果说明:酶被固定后,

其酸碱稳定性提高.这是因为MCS -M 和CS -M 在酶周围形

成的微环境具有一定的稳定性和缓冲能力,即使溶液主体的

p H 发生变化,经过微环境的调节,使得酶所在区域的变化46福建师范大学学报(自然科学版)第21卷